《中草药CTHD》：基于代谢组学和生物信息学的益胃饮干预胃癌前病变机制研究

【写在前面】：昨天的问卷调查显示大家比较关注生信方面的文章(问卷调查：选择您最希望我们公众号推送的文章类型)，今天向大家推荐一篇近日发表于《中草药》期刊的文章。例文为基于代谢组学和生物信息学的益胃饮干预胃癌前病变机制研究（DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2020.21.011，也可点击原文链接获取原文）。该文由浙江中医药大学/浙江中医药研究院的柴可群团队完成。

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【期刊简介】

来自CNKI

胃癌（gastric cancer，GC）是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一^[1]。胃癌前病变（gastric precancerous lesions，GPL）是胃癌炎癌转化的重要阶段，包括慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃早癌等不同阶段^[2]。GPL具有双向转化的特点，早期干预和治疗可有效逆转胃癌的发生发展，现已成为胃癌二级预防的重点研究领域^[3-4]。

益胃饮是浙江省名中医柴可群教授治疗胃癌前病变、胃癌的临床经验方，此方取健脾益气、袪瘀化痰、清热解毒3法，具有扶正气、调胃气、抗邪毒的功效。课题组前期研究表明益胃饮可诱导人胃癌细胞凋亡，并显著抑制其增殖、迁移与侵袭^[5-6]；也可显著抑制小鼠转植性前胃癌术后复发和肺转移瘤的形成^[7]。经多年基础研究与临床实践证实，益胃饮可有效防治胃癌，但具体作用机制尚不明确。

代谢组学是系统生物学的一个重要分支，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴“组学”，其整体、宏观的指导思想与中药整体性作用一致，适用于中药及复方整体性评价和复杂干预体系研究^[8-9]。本研究通过构建N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导的胃癌前病变大鼠模型，并采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）开展血清非靶向代谢组学研究，寻找益胃饮防治胃癌前病变的关键代谢物，并通过生物通路分析（ingenuity pathway analysis，IPA）结合ELISA法验证，揭示益胃饮干预胃癌前病变的潜在作用靶点和机制，为益胃饮防治胃癌前病变的临床应用提供科学依据。

【数据分析和统计】（仅提供生信相关方法部分）

原始数据经ProteoWizard软件转换成mzXML格式，然后采用off-line XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正、峰面积提取操作。采用MetaboAnalyst4.0进行单变量统计分析，包括变异倍数分析（fold change，FC）、T检验、火山图分析（volcano plot，VP）；同时采用SIMCA-P13.0软件进行多元统计分析，数据经Pareto-scaling预处理后，进行模式识别分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。通过OPLS-DA模型筛选出VIP＞1的离子，结合单变量统计分析FC＞1.5且P＜0.05的限制条件，找到具有显著性差异的离子，作为潜在生物标记物。

代谢物鉴定及代谢通路富集  

差异离子鉴定表征可通过查询HMDB（http://www.hmdb.ca）、Metlin（http://www. metlin.scipps.edu）和MetDNA（http://metdna.zhulab.cn/metdna）等公共在线数据库，同时通过二级质谱数据进行确认，部分代谢物采用对照品确证，各鉴定表征离子需小于5×10⁻⁶。将通过单因素统计分析和多元统计分析筛选出的差异代谢物输入MetaboAnalyst4.0网站进行代谢通路分析，寻找相关代谢通路。

IPA分析

IPA是一款一体式综合在线分析软件，完全基于Ingenuity知识库收集的生命科学数据，以帮助了解各种分子的属性，如与基因、蛋白质、化学物质、药物活性成分途径相关的生物标记物和相互作用网络。将筛选得到的益胃饮显著回调的差异代谢物及其属性、相应变量通过Excel格式引入IPA软件，利用IPA软件中的Core Analysis模型进行分析，可以有效、直观地获取益胃饮干预胃癌前病变的潜在靶点和通路。

【结果部分】

1  益胃饮提取物化学成分分析

益胃饮提取物经UPLC-Q/TOF-MS分析，如图1所示，益胃饮提取物中主要含原儿茶酸、鸟苷、绿原酸、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、迷迭香酸、芍药苷内酯、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等成分。

2  GPL大鼠胃黏膜组织病理学分析

如图2所示，对照组大鼠胃黏膜表面光滑、色泽淡红，黏膜皱襞完整且厚薄适中；HE染色后光镜下可见胃黏膜组织腺体结构、形态、排列正常，细胞核位于基底部，呈椭圆形、噬碱性，细胞质着色浅淡，无病理核分裂。与对照组相比，模型组大鼠胃壁弹性较差，胃黏膜不完整、变薄，且呈多灶性萎缩；HE染色后光镜下可见腺体拥挤、形态不规则，并有复层、背靠背现象，细胞核深染、增大、极性消失、核分裂，重度非典型性增生明显。益胃饮低剂量组大鼠胃黏膜呈粉红色，腺体数量、腺体厚度、壁细胞有显著改善，腺体处于轻度异型增生。益胃饮高剂量组腺上皮主要停留在中、重度异型增生。AB-PAS染色结果显示，对照组蓝色部分较少，基本无肠化生现象；模型组伴肠上皮化生胃黏膜组织较多，蓝色部分显著，肠化生明显；益胃饮低剂量组蓝色部分减轻，表明肠化生明显减轻；益胃饮高剂量组未见显著改变。因此，根据大鼠胃黏膜病理学结果，选取对照组、模型组和益胃饮低剂量组血清样本进行代谢组学分析。

3  代谢组学分析

3.1  质量控制（QC）分析  质谱总离子流图采用X-500R质谱仪采集，采用QC样本比对法对系统稳定性进行分析评价，如图3所示，不同时期的样本中各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，未见明显偏离，说明在整个实验过程中仪器检测稳定，在实验中获得的代谢谱数据真实可靠，可以反应样本间的生物学差异。

3.2  峰提取  采用离线版XCMS软件进行峰提取，负离子模式下共提取离子峰5 765个，正离子模式下共提取离子峰5 921个。

3.3  单变量统计分析  如图4所示，红色点为差异离子，在负离子模式下共筛选得到846个差异离子，在正离子模式下共筛选得到861个差异离子。

3.4  多变量统计分析  PCA用来观察对照组、模型组和益胃饮低剂量组之间的总体分布趋势，观察给予益胃饮后的大鼠血清代谢物整体变化情况。PCA模型参数中R₂X表示模型解释率，Q₂表示模型预测能力。在本次PCA模型中负离子模式下R₂X为0.282，Q₂为0.021 5，正离子模式下R₂X为0.431，Q₂为0.005，说明本次PCA模型的解释能力较好而预测能力一般。如图5所示，对照组和模型组的血清代谢物在PCA得分图中完全分离，说明MNNG诱导的GPL模型大鼠血清代谢谱发生明显变化；益胃饮低剂量组与模型组产生明显区分，并向对照组方向偏移，说明益胃饮影响了GPL大鼠血清中的代谢物，对其体内的代谢紊乱进行调节。

采用OPLS-DA分析对照组和模型组样本，建立两者代谢物表达量与样品类别之间的关系模型。筛选VIP＞1的离子，作为可以显著区分两组样本的潜在生物标记物。R₂X表示模型解释率，Q₂表示模型预测能力。如图6-A和6-C所示，在对照组和模型组的OPLS-DA模型中，负离子模式下R₂X为0.262、R₂Y为0.879、Q₂为0.604；正离子模式下R2X为0.266、R₂Y为0.871、Q₂为0.548，表明模型解释能力和预测能力较好。利用7折交叉验证对对照组和模型组样本的OPLS-DA建模结果进行质量验证，如图6-B和6-D所示，负离子模式下R₂Y为0.678，Q₂为−0.12；正离子模式下R₂Y为0.763，Q₂为−0.197，说明模型稳定。

3.5  代谢物鉴定与表征  如表1、2所示，负离子模式下共鉴定代谢物9个，正离子模式下共鉴定代谢物16个。如图7所示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中有20个代谢物显著上升，3个代谢物显著下降；与模型组比较，益胃饮可显著回调其中的13个代谢物趋于正常水平，包括22-羟基二十二碳六烯酸酯、焦谷氨酸、(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳六烯酸、L-亮氨酸、二十碳五烯酸、神经鞘氨醇、花生四烯酸、11β-羟孕酮、鞘氨醇、前列腺素E2、N-甲酰基甘氨酸、20α-羟基-4-孕烯-3-酮、17α,21-二羟基孕烯醇酮。

3.6  代谢通路及网络分析  将上述筛选得到的差异代谢物输入Metaboanalyst 4.0网站进行代谢通路分析，得到益胃饮干预GPL所涉及的相关代谢通路，如图8所示，主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，鞘脂代谢，花生四烯酸代谢和类固醇激素合成代谢等代谢途径。

4  IPA分析

将益胃饮显著回调的13个差异代谢物及其属性、相应变量导入IPA软件进行生物途径分析，结果如图9所示，13个差异代谢物中有5个（20α-羟基-4-孕-3-酮、L-亮氨酸、鞘氨醇、前列腺素E2、花生四烯酸）被纳入构建分析预测网络，益胃饮干预GPL涉及ET-1、IL-8信号传导和组织因子在癌症中的作用等途径，指示益胃饮干预GPL与抑制ET-1、IL-8信号传导密切相关。

5  ET-1和IL-8含量测定

如表3所示，与对照组相比，模型组大鼠血清中ET-1、IL-8水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，益胃饮低剂量组能够显著降低大鼠血清中ET-1和IL-8水平（P＜0.01、0.05），益胃饮高剂量组只降低大鼠血清中ET-1水平（P＜0.05），对IL-8水平无显著影响，表明益胃饮低剂量组可显著抑制GPL大鼠ET-1、IL-8的高表达，改善炎性环境。

【讨论部分】

胃癌的发病率和死亡率位居恶性肿瘤前列^[10]。GPL是胃癌炎癌转化的重要阶段，其炎性进展与胃癌的发生密切相关。据不完全统计，慢性炎症导致全世界约20%恶性肿瘤的发生，炎癌转化机制研究备受科研学者关注^[11]。目前，慢性炎症参与肿瘤发生的病理机制多样，炎性微环境为研究热点^[12]。研究表明，在肝癌、胃癌、结肠癌等多种消化系统肿瘤发生进程中，炎症引起的氧化应激反应起到了促进作用^[13]。花生四烯酸及其衍生物是一类重要的调控炎症的介质，可经多条途径加重机体氧化应激和炎症反应^[14]。环氧化酶2（COX-2）是花生四烯酸代谢成前列腺素E2（PGE2）的关键酶。研究表明COX-2在胃癌患者中普遍高表达，可抑制细胞凋亡，并且与肿瘤侵袭与转移密切相关^[15]。COX-2的代谢产物PGE2是强促炎因子，介导靶细胞膜受体EP和JAK/STAT信号通路等途径的激活，从而影响肿瘤干细胞生长，促进癌症的发生发展^[16]。本研究通过代谢组学发现，MNNG诱导的GPL模型大鼠血清中花生四烯酸、PGE2等水平显著增加，反映了GPL组织中的炎症反应。益胃饮可显著回调花生四烯酸、PGE2水平，证实益胃饮对胃组织炎症有干预作用，表明益胃饮可以通过抑制炎症改善肿瘤炎性微环境，从而延缓胃癌的病变。

为进一步探究益胃饮的作用机制，本研究采用IPA建立生物分子相互作用网络，结果表明益胃饮干预GPL主要涉及ET-1、IL-8信号传导和组织因子在癌症中的作用等途径。ET是由21种氨基酸残基组成的具有血管活性的多肽，在多种恶性肿瘤中均高表达，其中以ET-1生理作用最强^[17]。ET-1主要作用于周围淋巴结，促使淋巴管生成，并促进恶性肿瘤新生血管形成，为肿瘤的侵袭、转移提供重要基础^[18]。研究表明，胃癌中ET-1蛋白表达较癌旁组织明显升高，且与胃癌的发生、发展、转移有关^[19]。ELISA检测结果证实益胃饮可显著降低GPL模型大鼠血清中ET-1水平，提示该途径可能是益胃饮干预GPL进程的关键靶点之一。

IPA分析提示益胃饮的作用机制可能与调控IL-8密切相关。IL-8又称为趋化因子CXCL8，是CXC促炎趋化因子家族成员之一，是一种重要的促炎因子和免疫抑制因子^[20]。IL-8可促进肿瘤细胞增殖，还可通过自分泌诱导癌细胞获得间充质表型，致使肿瘤微环境免疫调节的紊乱，加剧异型细胞免疫逃逸^[21]。高表达的IL-8可在一定程度上抑制肿瘤免疫应答，促进肿瘤进展，与胃癌患者生存期呈负相关，是潜在的预测胃癌预后的关键指标，具有一定临床应用价值^[20,22]。本研究结果显示，益胃饮可显著降低GPL模型大鼠血清中IL-8水平，提示IL-8介导的调节肿瘤免疫微环境途径可能是益胃饮干预GPL的关键靶点之一。

本研究在明确益胃饮可干预GPL的基础上，采用UPLC-Q-TOF/MS表征大鼠血清代谢物，发现13个与益胃饮干预GPL作用相关的潜在标志物，涉及不饱和脂肪酸的生物合成，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，鞘脂代谢，花生四烯酸代谢和类固醇激素合成代谢等代谢途径，提示益胃饮可逆转机体花生四烯酸-PGE2炎症通路，改善肿瘤炎性微环境，发挥干预GPL作用。进一步结合IPA分析和ELISA验证，表明益胃饮干预GPL与抑制机体ET-1、IL-8信号途径密切相关，可通过抑制肿瘤细胞的增殖、分化和转移，并改变免疫肿瘤微环境，从而干预GPL。本研究表明益胃饮可多层次、多途径抑制GPL进展，体现了中药复方多靶点、多环节调控特点，为后续深入探讨益胃饮防治GPL的作用机制提供研究基础，为益胃饮的临床应用提供科学依据。

参考文献略

来  源：董  宇，赵丽沙，邱  萍，吴人照，陈  伟，柴可群． 基于代谢组学和生物信息学的益胃饮干预胃癌前病变机制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(21):5478-5486.【如有侵权请联系删除】

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