基于“鼻-脑”通路细胞模型组探索相对分子质量及粒径因素对药物制剂经鼻入脑的影响

中医学认为，鼻为清窍，其气上通于脑；又鼻窍通过督脉和足太阳膀胱经与脑直接相通，故药物经鼻给药可治疗脑部疾病。现代解剖研究认为，药物在鼻内可经嗅区黏膜上皮以细胞转运和经嗅神经摄取并通过神经细胞轴索传递入脑。其中嗅神经通路可以绕过血脑屏障，实现快速高效递药入脑，是鼻腔给药脑靶向的关键所在^[1-2]。药物跨鼻黏膜上皮细胞，吸收进入血液循环，进而穿过血脑屏障进入脑组织，是鼻腔给药靶向中枢神经系统的主要间接途径。药物经鼻腔给药后，药物的入脑过程取决于经上述两种途径入脑的速度及程度^[3-4]。

现有的“鼻-脑”递送动物模型（大鼠、犬^[5-6]、兔^[7]、猴^[8]）主要为在体鼻模型灌流模型和体内药动学模型，然而上述动物鼻腔结构与人类相比存在较大差异，且对于药物、制剂经鼻入脑机理的阐释不够直观^[9-12]。课题组前期基于鼻脑通路生理特点构建了体外细胞模型组^[13]。以嗅神经鞘细胞（OECs）模拟嗅神经细胞，以Calu-3细胞模拟鼻黏膜上皮细胞，采用共培养方式构建了鼻-脑通路细胞模型组。

荧光素异硫氰酸酯右旋葡萄糖苷（fluorescein isothiocyanate-dextran，FD）和纳米银（silvernanoparticles，AgNPs）是常用的模型药物。FD是由异硫氰酸荧光素偶联葡聚糖形成的一种标记物，是由不同长度的葡萄糖分子链构成的被标记的多糖，可根据葡聚糖链的长度来调整相对分子质量（M_w），模拟不同M_w的药物。AgNPs比表面积较大，最初被应用于催化作用，由于其具有良好的生物相容性，是目前医学领域应用最为广泛的金属纳米材料^[14-15]。AgNPs粒径可控，分散性能好，可用于模拟不同粒径尺寸的纳米制剂。

本研究拟基于前期构建的细胞模型，以不同M_w［FD4（4 000）、FD10（10 000）、FD20（20 000）、FD40（40 000）］FD和不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs为模型药物研究药物M_w因素及纳米制剂粒径因素对药物经鼻转运入脑的影响，对于经鼻脑靶向递药系统的设计具有积极的意义。

1  仪器与试药

1.1  仪器

Series II型二氧化碳培养箱、Revco PLUS型−80 ℃低温冰箱，美国Thermo公司；CKX-41型倒置显微镜，日本Olympus公司；WSZ600高级体视显微镜，广州微域光学仪器有限公司；Heal Force生物安全柜，上海力华科技公司；FACSseq流式细胞分选仪，美国BD公司；Biohit微量移液器，芬兰百得公司；BS224S型电子天平，德国Sartorius公司；TDL80-2B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；SIM-F124型制冰机，日本SANYO公司；RiOs-DI3UV型纯水器，美国Millipore公司；307057型空气浴震荡摇床，江苏太仓豪诚实验仪器制造有限公司；30、100、200目细胞筛网，南京优尼生物科技有限公司。

1.2  试药

胎牛血清（FBS，澳洲血源，美国Gibco公司）；DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）；PBS缓冲液（pH 7.2～7.4）；青霉素-链霉素（双抗，含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、牛垂体提取物（BPE）、非必需氨基酸细胞添加因子（non-essential amino acids，NEAA）、0.25%胰蛋白酶（含1% EDTA），美国Gibco公司；XIV型胰酶、L-型多聚赖氨酸（PLL）、Forskolins、FD（FD4、FD10、FD20、FD40）对照品、（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs，美国Sigma公司；Anti-P75，美国Abcam公）；Calu-3细胞，购于中国协和医科大学。

1.3  实验动物

Wistar大鼠，不区分性别，24 h内乳鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。

2  方法

2.1  “鼻-脑”多通路细胞模型组合的建立

取乳鼠处死，分离嗅球，以酶消化法收集OECs，并采用Anti-P75特异性结合OECs神经因子受体，以流式分选技术对OECs细胞进行纯化与鉴定（激发波长488 nm，发射波长535 nm）^[12]。将OECs细胞以1×10⁶个/mL的密度接种于多聚赖氨酸包被的12孔板中，DMEM/F12（含10% FBS，1%双抗，2 μmol/L forskolin/L，20 ng/mL BPE）培养7 d（可见大量呈双极和三级状OECs）。将Calu-3细胞接种于翻转的Transwell悬挂小室的底部，4 h后细胞贴壁，正置Transwell小室，悬挂于12孔板中培养至汇合成细胞单层并形成紧密连接（跨膜电阻值TEER＞700 Ω·cm²），弃去直接接触细胞单层侧的培养基，气液培养24 h。将接种Calu-3细胞单层的Transwell小室悬挂于接种OECs细胞的12孔板中组合构成“鼻-脑”多通路细胞模型组（图1），用于后续试验。

2.2  含量测定方法的建立

2.2.1  FD（FD4、FD10、FD20、FD40）含量测定标准曲线的建立 分别精确称取适量FD4、FD10、FD20、FD40对照品，用空白HBSS溶液配制成如下质量浓度溶液（FD4：62.625、50.100、25.050、12.525、10.020、1.002 μg/mL；FD10：9.400、4.700、2.350、0.940、0.470、0.235 μg/mL；FD20：9.800、4.900、2.450、0.980、0.490、0.245 μg/mL；FD40：10.160、5.080、2.540、1.016、0.508、0.254 μg/mL），分别移取100 μL于96孔板荧光酶标仪测定吸光度（I），激发波长485 nm，发射波长525 nm。以质量浓度为横坐标（X），I值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程见表1，结果显示不同M_w FD的质量浓度和I值在各自质量浓度范围内线性关系良好。

测定时，每次获得样品后随即进行检测，每次样品检测均随行标准曲线。

2.2.2 不同粒径（20～100 nm）荧光AgNPs含量测定标准曲线的建立  分别精确移取1 mg/mL不同粒径的荧光AgNPs混悬液，用空白HBSS溶液稀释成如下质量浓度溶液0.125、0.100、0.050、0.040、0.025、0.020 μg/mL，分别移取100 μL于96孔板荧光酶标仪测定I值，激发波长488 nm，发射波长535 nm。以质量浓度为横坐标（X），I值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程见表2。结果表明20、40、60、80、100 nm荧光AgNPs的质量浓度和I值在各自质量浓度浓度范围内线性关系良好。

测定时，每次获得样品后随即进行检测，每次样品检测均随行标准曲线。 

2.3  不同M_w FD在“鼻-脑”多通路细胞模型组的吸收

考察不同M_w FD（FD4、FD10、FD20、FD40在“鼻-脑”多通路细胞模型组合转运和摄取。

实验前处理：以37 ℃空白转运介质HBSS缓冲液冲洗细胞单层3次，冲洗时先吸弃上层培养基（HBSS），再吸弃下层培养基（HBSS），加液时先将HBSS加入下层，再加入上层。将细胞单层于37 ℃空白转运介质HBSS缓冲液中预孵育20 min。

细胞单层转运研究：于基底侧室给予500 μg/mL FD的HBSS溶液1.5 mL作为供给池，同时接触OECs和Calu-3细胞单层，于AP侧给予空白HBSS液0.5 mL，作为接收池。在设定时间点，于实验开始后30、60、90、120、150、180 min时，从接收池中取样，随即加入相同体积的新鲜转运介质。取样100 µL于96孔板荧光酶标仪测定吸光度（I），激发波长485 nm，发射波长525 nm，计算含量，绘制药物的累积透过量（Q）-时间（t）曲线，计算表观渗透系数［P_app，P_app＝dQ/(dtCA)，式中dQ/dt为药物转运速率，A为聚碳酸酯膜面积，C为药物在供给池中的初始质量浓度］。

OECs摄取研究：在设定时间点，于实验给药开始后30、60、90、120、150、180 min时，弃去药液，加入4 ℃的PBS 1 mL终止摄取，快速清洗3遍细胞单分子层。每皿加入200 μL RIPA细胞裂解液，4 ℃预孵育30 min至裂解完全得细胞悬液。取150 μL细胞悬液加入500 μL甲醇，涡旋混合1 min沉淀蛋白，4 ℃ 15 000 r/min离心10 min，取上清100 μL于96孔板荧光酶标仪检测I值，测定FD质量浓度；另取20 μL细胞裂解液于96孔酶标板，BCA法测定蛋白含量。FD细胞摄取量以每克蛋白中所含药物量表示。

2.4  不同粒径荧光AgNPs在“鼻-脑”通路细胞模型组合的吸收

考察不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs在“鼻-脑”多通路细胞模型组合转运和摄取。

细胞单层转运研究：于基底侧室给予20 μg/mL不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs的HBSS溶液1.5 mL作为供给池，同时接触OECs和Calu-3细胞单层，于AP侧给予空白HBSS液0.5 mL，作为接收池。取样及检测操作同前，激发波长488 nm，发射波长535 nm。

OECs摄取研究操作同前。

3  结果

3.1  不同M_w FD在“鼻-脑”多通路细胞模型组中的转运与摄取

3.1.1  细胞单层转运研究  不同M_w FD（FD4、FD10、FD20、FD40）在“鼻-脑”多通路细胞模型组合Calu-3单层的转运均表现为极难吸收，结果见表3。结果显示，FD4～FD40（M_w 4 000～40 000）随M_w增大其跨膜转运表观渗透系数（P_app）减小，且均小于1.0×10⁻⁷ cm/s，提示M_w 4 000以上水溶性大分子经鼻给药难以通过跨细胞转运和细胞旁路途径经鼻吸收。

3.1.2  OECs摄取研究  不同M_w FD（FD4、FD10、FD20、FD40）在“鼻-脑”多通路细胞模型组合OECs的摄取结果见图2。OECs对不同M_w FD的摄取在0～90 min均表现出随摄取时间延长摄取量增加，90 min后，药物摄取量趋于饱和。由图2可知，与FD4组比较，在相同摄取时间OECs对不同M_w FD的摄取量有显著性差异（P＜0.05），且随着M_w的增大呈明显下降趋势，提示嗅神经鞘细胞对水溶性大分子的摄取能力随相对分子质量增加而降低。M_w因素对于药物经鼻转运入脑具有重要影响作用。

3.2  不同粒径荧光AgNPs在“鼻-脑”多通路细胞模型组中的转运与摄取

3.2.1  细胞单层转运研究  不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs在“鼻-脑”多通路细胞模型组合Calu-3单层的转运P_app，随纳米粒的粒径增大而减小，具体结果见表4。当纳米粒粒径小于40 nm，其在Calu-3的转运特性表现为中等吸收 （1.0×10⁻⁶＜P_app＜1.0×10⁻⁵），纳米粒粒径大于60 nm，其转运特性表现为难吸收（P_app＜1×10⁻⁶）。

3.2.2  OECs细胞摄取研究  不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs在“鼻-脑”多通路细胞模型组合OECs的摄取结果见图3。OECs对不同粒径荧光AgNPs的摄取在0～60 min均表现出随摄取时间延长摄取量增加，60 min后，纳米粒摄取量趋于饱和。由图3可知，与20 nm组比较，相同摄取时间内OECs对不同粒径纳米粒的摄取量有显著性差异（P＜0.05），且随着粒子粒径增大呈明显下降趋势。

由不同粒径（20、40、60、80、100 nm）荧光AgNPs在“鼻-脑”多通路细胞模型组合转运和摄取结果可知，鼻腔内药物吸收与纳米制剂的粒径密切相关，粒径在40 nm以内的纳米粒更易于吸收，大粒径纳米粒不易吸收。纳米制剂主要通过膜动转运的方式进行吸收，其吸收程度与速度随纳米粒粒径增大而降低。

4  讨论

构建细胞模型过程中，本课题以流式分选技术纯化OECs，质量分数高达99.7%，优于常应用的差速贴壁法^[16]，有丝分裂抑制剂法^[17]和免疫亲和吸附法^[18]等纯化方法。本实验中所构建的细胞模型是由神经细胞模型和黏膜细胞模型组合而成，二者分别建立，然后通过Transwell培养板组合。本模型为实验团队首次创立，相关标准有待进一步深入研究后逐步完善。目前初步设定OECs细胞纯度达到95%以上，Calu-3细胞单层跨膜电阻值达到700 Ω以上即认为可以组合为鼻-脑多通路模型组。

相对于传统动物黏膜模型而言，本模型具有一定的优势，但也存在一定的不足：①由于目前没有来源于鼻腔黏膜的细胞系，本研究以Calu-3细胞（人肺腺癌细胞）模拟鼻黏膜细胞。虽然Calu-3细胞也属于上皮细胞，但若能采用鼻黏膜来源的上皮细胞构建模型，将能够更大限度的模拟鼻-脑通路。②鼻腔中嗅神经与黏膜细胞共生，嗅神经由嗅鞘包裹；由于神经细胞不可传代，在本研究中以嗅鞘细胞模拟药物经神经吸收的入脑通路，如能对嗅神经元进行纯化，构建模型，则更符合鼻腔生理特点；但因嗅神经元不可传代，每次实验均需取材培养，时间成本、经济成本耗费巨大。

药物的吸收过程及体内行为是由物理药剂学因素和生物药剂学因素综合作用的结果。上述因素具体包括药物的理化因素（如M_w、pKa、油水分配系数等）、剂型因素（如纳米制剂粒径、辅料种类等）、机体因素（如生理、病理等）、配伍因素（如中药复方配伍）等^[19-20]。通常情况下，在研究某一因素时往往会引入多个变量，因而所得结论不够严谨。如在研究M_w因素时，若选用不同药物进行对比，将导致多元变量同时存在，如选用乙醇与蔗糖，二者M_w不同、极性不同、药理作用不同（乙醇本身具有一定的促透作用）。若采用模型药物或者模型制剂则更便于控制因素变量，所得结论相对而言更为严谨。因此，本研究在课题组前期所建立的细胞模型组的基础上，选择模型药物FD和AgNPs对影响药物、制剂经鼻入脑的M_w因素、粒径因素进行了初步探索，为大分子类药物鼻用制剂的设计与开发提供理论依据。当前研究显示M_w大于400时药物输送受其自身理化性质影响较大，M_w大于1 000时药物生物利用度通常极低^[21-23]。目前，文献研究显示经鼻递药能提高胰岛素^[24]（M_w 5 808）、神经毒素^[25]（M_w 6951）、促红细胞生成素^[26]（M_w 34 000）、hIGF-I^[27]（M_w 7 785）等一系列大分子药物的入脑药量^[24-26]。上述药物的跨细胞单层转运特性及细胞摄取特性尚不明确，故本研究设计药物M_w为4 000～40 000。

目前，在大量经鼻递药研究中采用纳米制剂载药，本研究显示，当纳米制剂粒径在40 nm以下时，其在黏膜的转运特性表现为中等吸收，纳米粒粒径大于60 nm时其转运特性表现为难吸收；OECs细胞对于20 nm纳米粒的摄取量约为40 nm组的2倍，60 nm组的6倍，80 nm组的10倍，由此可知，在制备纳米经鼻递药系统时控制粒径参数对于提高入脑药量具有重要价值。

鼻腔给药为脑病（如肿瘤、中风等疾病）的治疗提供了一种具有前景的给药方式，通常认为这一给药方式为递送大分子类药物及其纳米制剂入脑带来了希望^[28-29]，然而由于目前鼻-脑通路体外模型的缺乏，在探索药物及制剂经不同途径入脑方面的研究还不够直观，对于药物制剂经鼻-脑通路入脑影响因素的研究尚不够深入。本研究中设计的OECs细胞与Calu-3细胞间接共培养模型可以在一定程度上模拟在体情况下的鼻腔给药，实现药物同时与黏膜上皮细胞和神经细胞的接触，黏膜转运与神经细胞摄取的同步进行，在经鼻递药制剂的研发、评价及预测方面极具应用潜力。

参考文献（略）

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