浙中医大基础医学院发表：基于网络药理学和分子对接探究芍药汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种以腹泻、便血为特征的位于直肠至结肠段黏膜和黏膜下层的慢性炎性肠病^[1]。其发病机制复杂，与遗传易感性^[2]、环境因素、生活方式^[3]、肠道菌群失调^[4]、免疫紊乱^[5]等密切相关。截至2017年，我国UC患病率高达0.011 6%^[6-7]，而现代医学尚无特殊治疗药物^[8]。由于其反复发作，迁延不愈，严重影响患者的工作和生活质量，因此开发有效的防治药物刻不容缓。

传统医学中本无UC病名的记载，但根据UC的临床症状，可将其归属于“痢疾”“便血”“大肠泄”等范畴。中医认为“大肠湿热”为其主要病因病机，故治疗上多以“清热燥湿”为主^[9-10]。芍药汤为一首主治湿热痢疾的经典名方，由刘完素创于《素问病机气宜保命集》，具有调气和血、清热燥湿的功效^[11]，被广泛用于UC的治疗^[12-13]，且疗效确切。然而，对于芍药汤治疗UC的作用机制尚不明确。网络药理学通过数据挖掘，系统的对复杂药物进行研究，能够揭示中药复方与疾病之间的关联性，为深入探究其药效物质基础与分子机制提供科学参考。因此，本研究通过网络药理学初筛，以及实验验证，探讨芍药汤治疗UC的物质基础和分子机制，为临床与实验研究提供思路和依据。

1  材料与方法

1.1  芍药汤活性成分及其靶点

利用TCMIP（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）和TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库获取芍药汤中9种药物的所有成分。其中，TCMIP通过限定相似性分数≥0.8来筛选化合物，而TCMSP通过设定药动学（ADME）参数^[14][口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18）、人结肠腺癌Caco-2细胞渗透性≥−0.4]来筛选化合物，所筛选的化合物即为活性成分，应用Cytoscape 3.7.2绘制中药-活性成分网络图。通过TCMIP和TCMSP获取活性成分对应的药物靶点，将结果导入Unitprot（http://www. Unitprot.org/）转化为统一的基因名，限定基因来源为人源性。

1.2  UC疾病靶点筛选

通过GeneCard（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）数据库得到与UC相关的疾病靶点，并与芍药汤的药物靶点相匹配获取交集靶点。利用Cytoscape3.7.2软件将结果可视化，并构建芍药汤活性成分-交集靶点网络图。

1.3  PPI网络构建

将交集靶点导入String（http://string-db.org/cgi/input.pl）数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），将结果导入Cytoscape 3.7.2，借助Cyto NCA插件中的Degree、Betweenness、Closeness、Eigenvector、LAC、Network等参数筛选节点，将连接度大于等于2倍中值的节点确定为关键靶点。将关键靶点与对应的化合物联系起来，导入Cytoscape3.7.2作图，根据度值筛选，得到芍药汤治疗UC的关键成分。

1.4  GO和KEGG分析

将关键靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO和KEGG富集分析，获取关键靶点的生物学信息，并分析芍药汤治疗UC的可能作用机制。

1.5  分子对接

将PPI网络中排名前10的关键成分分别与对应的关键靶点进行分子对接，以验证成分-靶点之间的可能性。从RCSB PDB数据库和PubChem数据库获取靶点与成分的三维结构和化学结构，利用SYBYL-X 2.0软件中的Surflex-Dock对接程序对上述结构进行对接，获得Total Score分值。

1.6  体内实验

1.6.1  实验动物 SPF级SD大鼠60只，体质量（200±20）g，实验动物许可证号：SYXK（浙）2019-0024，常规饲养于浙江中医药大学动物实验中心。

1.6.2  药物 芍药汤组成：生白芍30 g、当归15 g、黄连15 g、黄芩15 g、大黄9 g、槟榔6 g、木香6 g、肉桂5 g、甘草6 g（购于浙江中医药大学中医门诊部）。生药煎剂为2 g/mL为高剂量组、稀释1倍，1 g/mL为中剂量组、稀释2倍，0.5 g/mL为低剂量组。美沙拉嗪缓释颗粒（0.5 g/袋，批号190310，上海爱的发制药有限公司）于研钵中研成粉末，蒸馏水配制成0.04 g/mL的混悬液。

1.6.3  主要试剂和仪器  2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，5%水溶液，Sigma，货号P2297）；无水乙醇（双林化工，货号200773）；肿瘤坏死因子α（TNF-α，酶免，货号MM-0180R2）、白细胞介素4（IL-4，酶免，货号MM-0191R2）、趋化因子受体4（CXCR4，酶联，货号ml038254）ELISA试剂盒；M200 pro多功能酶标仪（Tecan）。

1.6.4  造模及分组  参照文献方法^[15]，以5% TNBS 0.09 mL＋无水乙醇0.06 mL灌肠复制UC大鼠模型。造模成功后，随机分为对照组、模型组及芍药汤低、中、高剂量组和美沙拉嗪组，10只/组。各组给药干预，对照组和模型组分别ig等剂量的生理盐水。给药量为10 mL/kg，按人体表面积^[16]计算，芍药汤低、中、高剂量组分别ig 5、10、20 g/kg芍药汤。美沙拉嗪组ig 0.4 g/kg美沙拉嗪混悬液。干预1周。

1.6.5  疾病活动指数（DAI）^[17]  每日观察并记录大鼠体质量、大便性状和大便隐血情况，见表1，计算DAI。

DAI＝(体质量下降率＋大便性状得分＋大便隐血得分) /3

1.6.6  标本采集 末次给药后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，析出血清分装，−80 ℃保存备用。剪取距肛门8 cm处结肠，迅速投于组织固定液中浸泡，24 h后进行石蜡包埋及HE染色。

1.6.7  病理观察 结肠组织石蜡包埋，切片，HE染色后，光学显微镜下观察各组结肠组织的病理变化。

1.6.8  TNF-α、IL-4、CXCR4水平测定  严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-4、CXCR4的水平。于酶标仪450 nm处测定吸光度（A）值，绘制标准曲线，根据A值计算各组TNF-α、IL-4、CXCR4含量。

1.6.9  统计学方法  采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8软件进行分析，计量资料以`x±s表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析。

2  结果

2.1  芍药汤活性成分及其靶点

通过TCMIP和TCMSP数据库的挖掘，删除重复项后，共得到1 180个化合物。经过筛选，最终得到424个活性成分。利用TCMIP和TCMSP数据库共获得805个药物靶点，见表2。利用Cytoscape 3.7.2绘制中药-活性成分网络图，见图1。

2.2  芍药汤活性成分-交集靶点网络图

通过GnenCard和OMIM数据库共获得4 453个疾病靶点。将这些靶点与药物潜在靶点进行匹配后，共得到207个交集靶点。利用Cytoscape3.7.2软件绘制芍药汤活性成分-交集靶点网络图，见图2。从图中可见，芍药汤治疗UC是通过“多药物-多成分-多靶点”相互作用实现的。

2.3  PPI网络构建与分析

将207个交集靶点导入String数据库，构建PPI，共得到207个节点，2 502条边，将结果导入Cytoscape进行筛选后，共得到41个关键靶点，如图3所示，这些靶点可视为芍药汤治疗UC的关键靶点。将这41个靶点对应化合物进行网络构建，如图4所示，根据度值筛选前10味成分为槲皮素（quercetin）、棕榈酸（palmitic acid）、儿茶素（catechin）、原花青素B2（procyanidin B2）、原花青素B1（procyanidin B1）、山柰酚（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、原花青素B3（procyanidin B3）、肉豆蔻酸（myristic Acid）、亚油酸（linoleic acid），这些成分可能为芍药汤治疗UC的主要成分。

2.4  GO分析

利用DAVID对芍药汤治疗UC的41个关键靶点进行GO分析，通过设定P＜0.05的指标，选取排名前10项，见图5。芍药汤主要通过细胞质、细胞核、胞质溶胶、胞外间隙、线粒体等细胞组分参与RNA聚合酶ΙΙ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、转录的正调控（DNA模板）、细胞对内毒素的反应、NF-κB转录因子活性的正调控等生物学过程，发挥酶结合、相同蛋白质结合、转录因子结合等分子功能，从而起到治疗UC的作用。

2.5  KEGG通路分析

将41个关键靶点导入DAVID数据库进行KEGG通路分析，共得到103条通路，通过设定P＜0.05的指标，选取前40条通路，见图6。如图显示，这些关键靶点主要富集在TNF、HIF-1、癌症途径、TLR、NOD、FoxO、T细胞受体、PI3K-Akt、VEGF、FcεRI、鞘脂、Ras、NF-κB等信号通路。

2.6  分子对接结果

利用Surflex-Dock对接程序对PPI网络中排名前10的关键成分与相应关键靶点进行分子对接后，得到Total Score分值，如表3所示。通常Total Score分值越大，表示配体与靶蛋白受体结合越稳定，当分值大于5时说明分子与靶点有较好的结合活性，分值大于7则说明分子与靶点的结合构型具有强烈的活性^[18-19]。表中91.9%的对接分值大于5，表明这10种成分与靶点结合性能好，能在一定程度上验证成分-靶点之间的结合活性。其中槲皮素（quercetin）与ICAM1结合性最好（图7），从图中可看出槲皮素与ICAM1相互作用，结合后呈现稳定状态。

2.7  芍药汤对DAI的影响

与对照组相比，模型组中DAI显著升高（P＜0.001），症状表现明显；与模型组相比，芍药汤能够显著降低DAI（P＜0.001），改善症状，结果见图8。

2.8  芍药汤对结肠病理损伤的影响

光学显微镜下观察发现，对照组中结肠黏膜完整，无增生水肿，无杯状细胞破坏，无炎性细胞浸润。与对照组相比，模型组见大量腺体破坏，明显的炎性细胞浸润。对模型组相比，芍药汤低、中、高剂量和美沙拉嗪干预后，可显著减少炎性浸润及腺体破坏，其中，芍药汤高剂量组效果优于其他组，表明芍药汤能明显改善UC病理损伤，见图9。

2.9  芍药汤对血清细胞因子表达水平的影响

与对照组相比，模型组中TNF-α、CXCR4表达显著升高（P＜0.001），而IL-4表达显著降低（P＜0.001）。与模型组相比，芍药汤可显著降低TNF-α、CXCR4表达（P＜0.01、0.001），显著上调IL-4表达（P＜0.001），其中以芍药汤高剂量组作用最明显，见图10。

3  讨论

目前，药物治疗仍是UC治疗的主要措施，其目的在于控制肠道炎症和改善免疫紊乱^[20-21]。然而，随着抗炎药物和免疫抑制剂如皮质类固醇、氨基水杨酸和抗TNF-α抗体等在临床中的大量应用，其不良反应日渐突出^[22]。中医药在肠病的治疗中积累了不少行之有效的方药^[23-26]。其中，芍药汤作为治疗湿热痢疾的经典名方被广泛用于UC的治疗^[27-29]。然而，中药的复杂性对其作用机制的研究造成一定困难。系统药理学是由Hopkins^[30]提出的一个新概念，最初应用于复杂化合物药物的研发，它使人们对药物的内在机制有了更好的理解。近年来，系统药理学被广泛用于研究传统中药方剂，为作用机制的研究提供了新方法和思路^[31]。

本研究通过网络数据库筛选，最终获得424个活性成分和805个药物靶点。药物靶点与疾病靶点匹配后得到207个交集靶点，通过构建PPI网络并借助Cyto NCA插件中的参数筛选出41个关键靶点，包括IL6、TNF、ICAM1、TLR4、STAT3、MAPK等。对41个关键靶点对应的化合物构建网络，根据度值筛选前10味成分为槲皮素、棕榈酸、儿茶素、原花青素B2、原花青素B1、山柰酚、谷甾醇、原花青素B3、肉豆蔻酸、亚油酸。其中槲皮素具有良好的抗氧化能力，可有效抑制结肠炎性损伤^[32-33]；原花青素对UC大鼠具有治疗作用，其机制可能是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与NF-κB信号转导通路来影响炎性因子^[34-35]。ICAM1为目前研究较多的细胞间黏附分子之一，有实验表明ICAM1缺陷小鼠可避免DSS诱导的严重的结肠炎症，说明ICAM1可调节炎症反应^[36]；MAPK是细胞内外信号传导的重要传递者，参与了UC发病过程^[37-38]。以上表明芍药汤可能通过本次筛选的槲皮素、棕榈酸、原花青素等成分作用于ICAM1、MAPK等靶点发挥治疗UC的作用，分子对接也验证了以上筛选的化合物和靶点之间确有结合活性。

GO分析表明芍药汤中活性成分可能通过细胞质、细胞核、胞质溶胶、胞外间隙、线粒体等细胞组分参与RNA聚合酶ΙΙ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、转录的正调控、细胞对内毒素的反应、NF-κB转录因子活性的正调控等生物学过程。这些结果提示芍药汤可能作用于多细胞组分产生不同生物学功能，从而发挥治疗UC的功效。

KEGG富集分析表明芍药汤治疗UC的41个关键靶点主要参与TNF、HIF-1、癌症途径、TLR、NOD、FoxO、T细胞受体、PI3K-Akt、VEGF、鞘脂、Ras、NF-κB等信号通路。TNF-α为重要的促炎因子，本研究通过体内实验发现，芍药汤干预后，大鼠结肠组织病理损伤减轻，TNF-α水平显著降低，而IL-4水平显著升高，说明芍药汤可能通过TNF信号通路抑制TNF-α的生成，从而减轻结肠炎症。此外，CXCR4为重要的趋化因子受体，其下游包含MAPK、PI3K/Akt、NF-κB和JAK/STAT信号通路^[39]，芍药汤可显著降低CXCR4表达水平，从而推测其可能通过抑制CXCR4介导的一系列信号通路，发挥调控炎症的作用。NF-κB是一种经典的转录因子，它调节控制细胞凋亡、增殖、细胞应激反应、免疫和炎症反应的基因转录^[40]，而PI3K/Akt为NF-κB的上游通路，通过靶向PI3K/Akt信号通路，能够调控免疫和炎症反应，在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中发挥关键作用^[41-42]，如氧化苦参碱通过抑制PI3K/Akt信号通路，减少Th1和Th17细胞分化，促进炎症细胞和免疫细胞凋亡，发挥免疫调节、促凋亡、抗炎等作用，以改善UC肠道病理表现^[43]。此外，JAK抑制剂被证明能有效治疗UC，JAK/STAT通路参与了UC的疾病过程^[44]。以上结果表明，芍药汤可能通过活性成分作用于IL6、TNF、TLR4、AKT1、STAT等关键靶点，激活或抑制TNF、TLR、PI3K/Akt、NF-κB等相关通路，产生抑制炎症、调节免疫、改善黏膜屏障等功效，从而发挥治疗作用。

综上所述，本研究利用网络药理学对芍药汤治疗UC的活性成分、关键靶点及可能的作用机制进行分析，揭示了芍药汤是以“多组分-多靶点-多通路”的方式发挥治疗作用；并通过分子对接验证了化合物与靶点之间的结合活性；体内实验证实了芍药汤治疗UC的有效性，并分析了可能作用机制。

参考文献（略） 

来  源： 卢爱妮，王德龙，赵  芳，陈瑞杰，陈薇乔，郑红斌，季旭明．基于网络药理学和分子对接探究芍药汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制 [J]. 中草药, 2020, 51(23):6035-6044.

转载自中草药公众号

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