关爱自闭症，关心自闭症研究：CRISPR/Cas9基因编辑诱导自闭症谱系障碍的核心症状研究

原创 Mr lucky yang 如沐风科研

【写在前面】：4月2日为世界自闭症日。本期推荐的是由中科院、云南省二院以及云南中医药大学等研究团队发表于Science Bulletin（IF9.511）的一篇有关自闭症的文章，通过在青春期恒河猴大脑中CRISPR/Cas9的基因编辑诱导自闭症谱系障碍的核心症状。也是提醒大家：关爱自闭症，关心自闭症的研究。

【题目及作者信息】

Induction of core symptoms of autism spectrum disorders by in vivo CRISPR/Cas9-based gene editing in the brain of adolescent rhesus monkeys

【摘要】

虽然CRISPR/Cas9介导的基因编辑被广泛应用于模拟人类疾病，但大脑中致病基因的急性操作是否会导致非人类灵长类动物的行为异常仍有待确定。在这里，我们通过腺相关病毒(AAV)传递的针对MECP2的sgRNA，在青少年恒河猴(Macaca Mulatta)的海马(DG和CA1-4)中诱导了MECP2的基因突变，MECP2是一个与Rett综合征(RTT)和自闭症谱系障碍(ASDS)相关的关键基因。与单纯注射AAV-SaCas9的猕猴(n=4)相比，注射AAV-SaCas9-sgMECP2的猴(n=7)出现了大量的自闭症样行为异常，包括社会交往障碍、睡眠模式异常、对厌恶刺激不敏感、手运动异常和社会奖励行为缺陷。此外，ASD和RTT的某些方面，如刻板行为，在MECP2基因编辑的猴子中没有出现，这表明不同的大脑区域可能导致不同的症状。这项研究表明，通过体内基因编辑对致病基因的急性操作直接导致青少年灵长类动物的行为变化，为快速生成用于神经生物学研究和治疗开发的基因工程非人类灵长类动物模型铺平了道路。

【前言】

孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一类严重的发育障碍性疾病。其特征是患者出现类似孤独症的行为，如社会交流障碍，语言交流障碍和重复刻板行为等，罹患ASD疾病的少年儿童很难接受正常的教育过程并融入社会。目前ASD的发病机制并不完全清楚，但已有充分的证据表明MECP2基因突变与该疾病的发生有着密切联系。因此通过基因编辑技术在动物体内对MECP2基因进行编辑和建模是目前研究该疾病的重要手段。而非人灵长类，尤其是猕猴属于群居动物，与人类的基因相似度高达93.5%，与人类在生理结构、发育过程、大脑功能和行为表现上非常相近。在研究具有典型社交障碍的ASD疾病方面，非人灵长类具有明显优势，因此研究MECP2基因在非人灵长类体内产生的病理学效应具有深远的意义。目前主流的MECP2转基因非人灵长类模型主要基于胚胎转基因技术构建，虽然此类猴模型具有非常重要的应用前景，但其存在制作周期长、成功率低、成本高及嵌合体等问题。

针对上述问题，研究者将携带CRISPR/Cas9的腺相关病毒（AAV）特异地注射到猕猴调控社交记忆的海马脑区，这些病毒表达后可以激活CRISPR/Cas9工具，从而对猕猴海马脑区的MECP2基因进行编辑。在病毒注射后，研究人员通过对猕猴多种行为的长期跟踪监测后发现：基因编辑猕猴出现了社交障碍，睡眠节律紊乱等多种与孤独症患者核心症状十分相似的行为改变（图1）。有趣的是，刻板运动等另一部分孤独症核心症状却没有在这些基因编辑猴中被观察到。此现象提示我们，有可能不同的脑区在该疾病的发生发展中扮演着不同的角色，通过此研究方法，我们可以拆分复杂脑疾病不同症状与不同脑区间的联系。同时研究结果显示该技术能够快速高效地在猕猴上复制出疾病相关的症状，为今后探索快速构建转基因工程猕猴疾病模型奠定了十分良好的基础。

【结果部分】

1. SaCas9的sgRNAs设计、注射方案和体内验证

2. 具有急性MECP2基因编辑的猴子表现出异常的社会行为。

3. 具有急性MECP2基因编辑的猴子表现出异常的攻击行为。

4. 急性MECP2基因编辑猴的低活性和异常睡眠模式。

5. 带有MECP2基因编辑的猴子在社会奖励和注视跟踪方面表现出缺陷

6. 具有MECP2基因编辑的猴子对厌恶性感觉刺激表现出异常反应，并且重复行为没有改变。

讨论

我们表明，AAV传递的CRISPR/Cas9基因编辑有效地诱导了青春期恒河猴海马中MECP2的缺失，这导致了核心的ASD样表型，包括社会交流和相互作用的缺陷、对感觉输入的低敏感性、日间活动不足、异常睡眠模式、异常手部运动和社会奖励缺陷。因此，这些结果表明，与传统的胚胎转基因或基因编辑策略相比，特定脑区中基于病毒的基因编辑可用于快速开发模仿ASD样症状的猴子模型，并缩短建模周期。这项工作与早期的研究一致，表明小鼠有丝分裂后神经元中MECP2的缺失会导致突触可塑性和RTT样行为的缺陷]。此外，我们通过揭示海马MECP2在社会行为调节中的重要作用，扩展了以前的发现。有趣的是，猴子海马体中MECP2的缺失不足以概括刻板行为，这在MECP2转基因和突变猴子中观察到。这些结果表明，不同的大脑区域在自闭症谱系障碍中具有不同的功能，并可能介导不同的自闭症谱系障碍症状。例如，基底外侧杏仁核中MECP2的特异性敲除可以产生高度焦虑样行为，而不是社交互动中的异常。这表明，使用我们的模型可以在不同的大脑区域分别研究自闭症样症状，从而揭示基因和特定神经回路之间的联系。成年期MECP2的恢复已被证明可以挽救MECP2敲除(KO)或过表达(OE)小鼠的行为和生理缺陷。之所以说MECP2在大脑中丢失导致的缺陷在出生后是可逆的，可能是因为MECP2通过转录抑制来调节大脑发育，以及对microRNA加工的调节。将MECP2恢复到正常水平可能能够通过纠正由小鼠模型中MECP2功能丧失或获得引起的异常基因表达来恢复特定神经回路中受损的突触可塑性。目前的发现表明，非人灵长类动物中负责社会行为的神经回路也是可塑性的，可以在青春期进行操作。灵长类动物出生后社会回路操作的可行性表明，有可能逆转人类RTT病和自闭症患者的自闭症缺陷。

这项研究于近期在Science Bulletin 杂志在线发表，该研究工作主要由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）与中科院昆明动物研究所联合博士后吴诗昊完成，中科院上海神经研究所的仇子龙研究员，中科院昆明动物研究所的胡新天研究员以及云南省第二人民医院的尹勇副院长为该论文的共同通讯作者。复旦大学李霄博士，云南中医药大学的秦冬冬教授以及中科院昆明动物研究所的张琳恒为本文共同第一作者。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）的陈枝芳博士，中科院昆明动物研究所任晓峰，谷依琳，苏境及罗询然亦对本研究有重要贡献。此项目得到了国家自然科学基金委、中科院战略重点研究计划以及国家重点研发计划等项目的资助。

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