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第三章

形态、分类学和结构

一、 系统分类学地位

从系统分类学的角度，冠状病毒属于网巢病毒目（Nidovirales）冠状病毒科正冠状病毒亚科冠状病毒属（Coronavirus）。

冠状病毒属分为4类：α、 β、 γ、 δ冠状病毒属。2018年，ICTV将β冠状病毒属进一步分为5个亚属：Embecovirus、 Sarbecovirus、 Merbecovirus、 Nobecovirus和Hibecovirus（表3-1）。其中前4个亚属分别对应原β冠状病毒属之下的A、 B、 C、 D 4个进化簇（lineages或clusters），Hibecovirus亚属则由分离于中国蝙蝠，且与Sarbecovirus亚属在系统发生上近缘的一类β冠状病毒属进化而来。感染哺乳动物的冠状病毒主要为α、 β冠状病毒属；感染禽类的冠状病毒主要来源于γ、 δ冠状病毒属。SARSCoV2目前被归于β冠状病毒属的Sarbecovirus亚属。

1965年，第1株人的冠状病毒被分离，由于在电子显微镜(电镜)下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。冠状病毒的名字“coronavirus”来自拉丁文的“corona”一词，表示“皇冠”之义。

SARSCoV2结构与其他冠状病毒类似，病毒颗粒外包着2层脂质的包膜，膜表面有3种糖蛋白：刺突（spike, S）蛋白；包膜（envelope, E）蛋白；膜（membrane, M）蛋白。冠状病毒颗粒呈不规则形状，直径为60~220nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。

2020年1月24日，中国疾病预防控制中心发布我国成功分离的第1株SARSCoV2电镜照片，如图3-1所示（箭头所指即SARSCoV2），病毒周围呈现多个典型的不规则颗粒突起。2月11日，美国国家过敏与传染病研究所在扫描和投射电镜下拍摄到了SARSCoV2的图像（图3-2）。图中可见病毒超微结构，其内部为核衣壳结构，钉状的突起位于病毒颗粒表面，符合典型的冠状病毒形态。人气道上皮超薄切片可见胞外游离病毒颗粒和胞质膜结合囊泡内充满病毒颗粒的包涵体（图3-3）。

二、 基因组进化分析

截至2020年2月23日，已有200多条SARSCoV2的基因组序列上传至GenBank、 GISAID、 Genome Warehouse （GWH）等平台共享，冠状病毒广泛的宿主性及自身基因组的结构特征使其在进化过程中极易发生基因重组，呈现遗传多样性。本部分根据SARSCoV2的全基因组和单个基因、蛋白序列进行比较基因组学和进化分析。

1.基于病毒全基因组的进化分析 

基于全基因组的比对结果，对SARSCoV2及下载自美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI）的代表性冠状病毒进行系统发育分析。如图34所示，发现这些病毒株可以明确分为α、 β、 γ、 δ 4个属。图中所示上方的进化分枝α、 β冠状病毒属感染的哺乳动物除人外，还包括蝙蝠、马、猪、牛和狗等。感染禽类的冠状病毒主要来源于γ、 δ冠状病毒属，位于进化树下方的分枝。

SARSCoV2与MERSCoV、 SARSCoV位于同一冠状病毒家族中。其中，β属的Sarbecovirus亚型可进一步分为3个进化枝：第1个进化枝包括此次分离的SARSCoV2临床分离株和Bat CoV RaTG13分离株（GenBank Accession MN996532.1）；第2个进化枝为来自中国东部舟山2个蝙蝠衍生的SARS样病毒株（BatSLCoVZC45, GenBank Accession MG772933.1和BatSLCoVZXC21, GenBank Accession MG772934.1）；第3个进化枝包括感染人的SARSCoV和多个来自中国西南地区的基因组相似的蝙蝠衍生SARSCoV病毒株。从遗传距离来看，SARSCoV2较SARSCoV更接近Bat CoV RaTG13分离株和蝙蝠衍生的SARS样病毒株。

在序列拼接的基础上进行核苷酸相似度比对发现，和来自中国与美国SARSCoV2分离株最近邻的是Bat CoV RaTG13病毒株，它从云南省的蝙蝠中分离得到，核苷酸序列一致性为96.2%。其次为2株蝙蝠冠状病毒BatSLCoVZC45和BatSLCoVZXC21，相似度分别为88.1%和88.0%，它们与SARSCoV基因组的相似度为79.6%（表3-2）。

根据系统进化分析（图3-4）和基因组相似性证据表明，SARSCoV2是一种来自β冠状病毒属Sarbecovirus亚型的新型β冠状病毒。

2. 基于病毒基因组的单个基因  

进一步的逐个基因序列比对显示，SARSCoV2在人类SARSCoV的几个区域均表现出显著的序列差异，包括ORF1a和S的N端区域、ORF3、 E、 ORF6、 ORF7、 ORF8，以及N的中间部分。

据表3-2所示，SARSCoV2的S基因和SARSCoV的相似度为73.4%，和Bat CoV RaTG13的相似度达到93.1%。在其他结构基因E、 M和N的比对中，E基因的相似度最高，均达到90%以上。SARSCoV2的M和N基因和SARSCoV的相似度分别为85.6%和88.8%。

SARSCoV2与来自蝙蝠的BatSLCoV ZC45和BatSLCoV ZXC21相比，ORF1b中的序列一致性（约86%）低于ORF1a中的序列一致性（约90%），即SARSCoV2的ORF1b基因与蝙蝠来源的病毒不一致，形成了独特的进化枝。提示可能在ORF1b基因中发生了重组事件，这个事件更有可能发生在蝙蝠来源的病毒上。图35~38分别为基于S基因、N基因、ORF1a基因和ORF1b基因绘制的进化树。如图3-7、 3-8所示，在进化关系上，SARSCoV2的ORF1b较BatSLCoVZC45、 BatSLCoV ZXC21的亲缘关系较远，而SARSCoV2的ORF1a较两者亲缘关系更近。

3. 基于氨基酸序列的比较基因组学分析  

SARSCoV2在蛋白序列上与Bat CoV RaTG13呈现高度一致，氨基酸序列一致性达95.0%~99.9%（表3-2）。与SARSCoV虽然也十分相似，但在某些编码基因上有一些显著差异，如ORF8编码蛋白和SARSCoV的一致性低于40%，ORF3编码蛋白的一致性仅为72.6%。而BatSLCoVZC45、 BatSLCoVZXC21、 Bat CoV RaTG13的ORF8编码蛋白和SARSCoV2却具有惊人的相似性，蛋白序列的一致性介于94%~95%。类似地，SARSCoV2与BatSLCoVZC45和BatSLCoVZXC21的ORF1a和ORF1b在蛋白水平上显示出了非常高的保守性，氨基酸序列一致性达95%~96%，尽管上文所述它们的核酸序列略有差异。

 SARSCoV2中最重要的S蛋白与BatSLCoVZXC21的S蛋白的氨基酸序列一致性为81.7%，与SARSCoV的S蛋白的相似性为76%。对S蛋白2个亚基S1、 S2的分析显示，SARSCoV2的S2亚基更加保守，与BatSLCoVZC45和BatSLCoVZXC21蛋白序列一致性约93%，远高于S1的68%。图3-9~3-12分别为基于S蛋白、N蛋白、ORF1a编码蛋白和ORF1b编码蛋白绘制的进化树。

ORF1ab编码蛋白包括的16种非结构蛋白（nonstructural protein, NSP）的氨基酸比对相似性，如表3-3所示，SARSCoV2与SARSCoV的NSP并无显著差异。

4. 时间序列分析  

截至2020年2月10日，根据Nextstrain平台（https://nextstrain.org/ncov）发布的基因组数据系统发育学分析，采用星形树模型计算得出SARSCoV2最早出现的时间约为2019年11月中旬（95% CI:2019年10月中旬~12月初）。

三、 病毒基因组结构

SARSCoV2为冠状病毒科正冠状病毒亚科β冠状病毒属中的一个具有E蛋白包被的，基因组约为29891个核苷酸（nucleotide, nt）的单股正链RNA病毒。

基于生物信息学的方法，将其核苷酸序列和同β冠状病毒属的其他冠状病毒，如SARSCoV、 MERSCoV、蝙蝠冠状病毒（BatCov）等，进行序列同源性比对和ORF预测，提示SARSCoV2具有12个潜在的ORF（图3-13），依次为5′复制酶结构蛋白（刺突包膜膜核衣壳）3′，即5′replicase （ORF1ab)structural proteins （SEMN）3′。

5′和3′末端非翻译区（untranslated region, UTR）的长度分别为265和229nt。其中5′UTR具有核糖体结合位点和转录起始信号，3′UTR具有转录终止信号，参与信使RNA（message RNA, mRNA）转录和蛋白质翻译过程。同时两区内还存在多个茎环结构，参与调控病毒复制。

ORF1ab编码复制酶多聚蛋白（polyprotein, pp）1a和pp1ab，2种蛋白经NSP3和NSP5特异性剪切后产生NSP1~16，不同NSPs的功能见表3-4。NSP1是拮抗先天免疫的重要调控分子。既往研究报道，在SARSCoV感染中，NSP1参与调控与细胞活化相关的钙调神经磷酸酶活化T细胞核因子（Calcineurinnuclear factors of activated T cells, CaNNFAT）信号通路，同时能够引起细胞因子的异常表达。NSP12和NSP13分别为依赖RNA为模板的RNA聚合酶和解旋酶，直接参与病毒的复制，因此NSP3和NSP5的剪切活性直接影响病毒后续的复制强度。鉴于nsp5为病毒特异性蛋白水解酶，因此NSP5被广泛认为是抗病毒药物筛选靶点。近期研究已解析其分辨率为1.75（1=0.1nm）的三维立体结构（图3-14）。NSP5为同源二聚体蛋白，具有3个关键的结构域，分别为糜蛋白酶样/小角朊病毒3C蛋白酶样结构域Ⅰ（氨基酸10~99位）、结构域Ⅱ（氨基酸100~182位）和结构域Ⅲ（氨基酸198~303位）。结构域Ⅰ和Ⅱ均含有6股反向β折叠构成的桶状结构，两结构域之间为底物结合位点。结构域Ⅲ具有5个螺旋结构，直接参与同源二聚体的形成。

S基因编码S蛋白，该蛋白包含S1和S2亚基，如图2-13所示，其中S1具有N末端结构域（Nterminal domain, NTD)和受体结合结构域（receptorbinding domain, RBD），这2个结构域在病毒识别并结合靶细胞膜表面受体过程中起重要作用。S2亚基具有氨基酸序列保守的融合肽（fusion peptide, FP）、七价重复（heptad repeat, HR）1和2、跨膜结构域（transmembrane domain, TM）和胞质结构域（cytoplasmic domain, CP）。S1亚基同膜受体ACE2结合后，S2亚基的空间构象发生变化，促进病毒外膜同靶细胞膜或内体膜融合，进而病毒核酸入胞。S蛋白的结构和入胞的机制将在下一节中详细讨论。

 ORF3、 ORF6、 ORF7a、 ORF7b、 ORF8、 ORF9b编码病毒的相关协助蛋白，虽然这些蛋白在SARSCoV2的生活史中发挥的具体功能尚不明确，但是已有文献报道ORF3和ORF6蛋白在SARSCoV感染过程中，能显著够抑制干扰素（interferon, IFN）信号通路，拮抗先天免疫。ORF7能通过激活核因子κB（nuclear factor kappaB, NFκB）信号通路，上调细胞因子白细胞介素8（interleukin8, IL8）和炎症性趋化因子5（CC cehemokine ligand 5, CCL5）的表达；ORF8能够引起胞内应激反应，促进NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NODlike receptor family, pyrin domain containing3，NLRP3）炎性小体的形成，这些蛋白在SARSCoV2中的作用仍需研究。

 E、M和N基因分别编码包膜蛋白、膜蛋白和衣壳蛋白，这些蛋白在病毒的组装、成熟、分泌等过程中起作用。E蛋白在冠状病毒中含量较少，是分子量为8~12kDa的跨膜结构蛋白，具有离子通道活性。研究表明，E蛋白在病毒复制中不起作用，但是其离子通道活性是冠状病毒致病性的重要原因之一。M蛋白在冠状病毒的所有结构蛋白中含量最为丰富，分子量为25~30kDa，具有3个跨膜结构域，在维持病毒形态过程中起重要作用。研究表明M蛋白在病毒颗粒中以二聚体形式存在，有助于同衣壳相互结合及维持病毒膜结构的曲率。N蛋白是目前已知的组成衣壳结构的唯一蛋白，其NTD和C末端结构域（Cterminal domain, CTD）能同冠状病毒RNA相互结合。研究表明N蛋白被高度磷酸化后有助于改变衣壳结构，进而特异性地筛选、结合冠状病毒RNA。

 （张  怡  沈忠良）

来       源

复旦大学出版社

编       辑

李映潼 丁辰琦