责编丨迦 溆

疱疹病毒（herpesviruses）是在世界范围内广泛传播的一大类双链DNA病毒，包含病毒的种类众多，能够感染包括人类在内的多种哺乳动物【1】。疱疹病毒在感染人体后能够引发多种疾病，包括口腔和生殖器疱疹、水痘、带状疱疹，严重的甚至包括多种免疫系统疾病、脑炎以及癌症等【2】。疱疹病毒在世界范围内广泛传播，以单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）为例，根据世界卫生组织2017年1月数据显示，全球约有42亿50岁以下的人（约80%）感染单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2）【3】。

疱疹病毒有着独特的潜伏-再活化机制，它可以关闭其大部分活动状态的基因，只在特定的潜伏阶段打开特定的少数基因，并在合适的条件下恢复活性，重新进入增殖过程。这种潜伏-再活化机制使得疱疹病毒感染产生的疾病难以完全治愈，通常患者会终生携带病毒。

疱疹病毒直径约为200 nm，包含四层结构，分别为表面囊膜、蛋白质中间层(tegument proteins)、核衣壳颗粒和DNA核心【1】。其中，核衣壳的直径约为125 nm，在病毒的复制、组装、成熟以及侵染过程中都起到非常重要的作用。核衣壳包含A、B、C三类，三类核衣壳均为非标准正二十面体。A型核衣壳内部为空，不包含其他蛋白和病毒基因组；B型核衣壳内部包含支架蛋白；C型核衣壳内部包含病毒基因组，并可以逐渐成熟，成为具有侵染增殖活性的成熟病毒。过去二十年，国际上很多科学家试图用冷冻电镜技术解析疱疹病毒核衣壳的三维结构，然而由于颗粒尺寸太大，导致冰层过厚、信噪比降低和埃瓦尔德球效应，为高分辨信息的重构带来技术瓶颈。

4月6日，Science杂志以研究长文（Research Article）的形式在线发表了饶子和院士团队王祥喜研究员等与湖南师范大学刘红荣教授和中科院生物物理所章新政研究员以及中国食品与药品检定研究院王军志教授等合作完成的题为Cryo-EM structure of a Herpesvirus capsid at 3.1 Å 的研究论文。该工作首次报道了疱疹病毒α家族的2型单纯疱疹病毒（HSV-2）核衣壳的3.1 Å的原子分辨率结构，阐明了核衣壳蛋白复杂的相互作用方式和精细的结构信息，并提出了疱疹病毒核衣壳的组装机制，为进一步研究病毒核衣壳与包膜蛋白的组装以及为疱疹病毒的抗病毒治疗奠定了基础， 同时能够以结构为基础的病毒设计成溶瘤病毒为治疗肿瘤提供了广阔的应用前景。 鉴于该工作的重要意义，BioArt特别邀请到了长期从事病原微生物结构生物学研究的中科院微生物研究所施一研究员以及冷冻电镜领域的青年才俊、耶鲁大学新晋PI张凯博士对上述工作进行点评，以飨读者！

在这项研究中，研究人员以HSV-2衣壳颗粒为研究对象，利用最新开发的冷冻电镜单颗粒重构的计算方法“分区计算法”和“欠焦值修正法”，解析了3.1 埃的核衣壳B颗粒，并搭建了结构模型，详细地分析了核衣壳中各结构蛋白的构象变化与蛋白之间的相互作用关系，阐释了病毒核衣壳早期组装的机制，为后续研究核衣壳在神经细胞的运输提供了扎实的结构基础（下图）。

图1. HSV2 核衣壳B颗粒整体三维结构

针对于“大尺度颗粒”的重构方法的应用，使得冷冻电镜结构解析的应用范围进一步推广，巨型病毒颗粒或亚细胞系级的超大蛋白质复合物的单颗粒重构可以实现近原子分辨率，将进一步推动结构生物学的进步与发展。

鉴于核衣壳结构在疱疹病毒中的重要性和保守性，针对疱疹病毒核衣壳结构的药物设计与分子筛选将很有可能研制出针对疱疹病毒的具有广谱性的药物，因此该工作所解析的核衣壳结构可以为此提供扎实的结构基础。

施一（中科院微生物研究所研究员，国家优青）

Comments：疱疹病毒是一类含囊膜的双链DNA病毒，是迄今为止已知的最大病毒之一，能够引起脑炎，口腔和生殖器疱疹，先天性缺陷甚至癌症等疾病。疱疹病毒科成员组成形式十分复杂，其核衣壳是最为复杂的结构之一，包含上千个蛋白亚基，是结构生物学领域的难点之一。目前已报道的具有类似核衣壳结构的人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）和Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）只得到了3.9 Å和4.2 Å近原子分辨率结构【4,5】。在最新发表的Science杂志上，王祥喜研究员、饶子和院士联合中科院生物物理所章新政研究员、湖南师范大学刘红荣教授和中国食品药品检定研究院王军志研究员首次从原子分辨率水平（3.1 Å）展示了单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）核衣壳的结构。从结构上看，疱疹病毒科不同成员核衣壳结构形式比较类似，但是局部结构细节存在明显差异，通过对这些结构的比较能为我们全面了解这类病毒基因组的包装机制和核衣壳稳定性提供重要信息，并为研发更好的抗病毒感染药物提供关键理论基础。

近几年来，科学家们借助冷冻电镜成功解析了很多病毒的结构，这些病毒通常具有严格的二十面体对称性。但在这项研究中，研究团队遇到了两个瓶颈。首先，对于疱疹病毒而言，由于构象柔性以及纯化过程造成的颗粒形变，使得这类病毒并不严格遵守二十面体对称性，从而导致每个不对称单位中还存在着一定程度的结构差异。另一方面，由于疱疹病毒颗粒的直径超过120 nm，每个颗粒的局部欠焦量（defocus）差异较大，因此存在ctf（contrast transfer function）校正不准的问题。为解决这两个问题，研究团队在数据处理上做了相应的改进和优化，他们把每一个不对称单位进一步拆分成多个板块，将每个板块分别进行重构，并分别计算空间角度和对称信息，然后再将这些板块拼接成完整的病毒结构。这一方法极大地提高了结构解析分辨率，并对于解析其它对称性大尺度病毒的原子分辨率结构将很有帮助。

张凯（耶鲁大学新晋PI）

Comments：如果说自然界有哪种病毒困扰着或曾经困扰过几乎每一个地球人，疱疹病毒肯定偷着笑了。人类单纯疱疹病毒1和2（human herpesvirus 1 and 2，HSV-1/2 ）会导致皮肤、口腔、眼角膜、生殖器官等常见感染。研究此类病毒显然具有极其重要的生物学和医学意义。从BioArt得知好友王祥喜博士与其导师饶子和院士，以及刘洪荣、章新政、王军志等多位教授领导的研究团队联合攻关，在HSV-2的冷冻电镜结构方面取得重大突破，获得3.1埃高分辨率结构，并最终以Science长文形式发表其研究成果，心里十分激动。事实上，我很早前就知道祥喜在这个课题上付出了巨大的心血，并且有了非常不错的结果，也了解他们投稿的一些细节。不过最终知道祥喜的论文被正式接受还是通过BioArt。由于我个人并没有太多病毒方面的研究经历，另外考虑到可能会有其他专家在病毒研究意义方面的评述，我作为一个病毒研究领域的“外行”也不能瞎点评，所以我就以仅从冷冻电镜技术方面对该工作做简单介绍。

正二十面体病毒、3.1埃分辨率，这乍一听，好像并没有像2.2埃、1.8埃这样的分辨率更加令人震撼。但我个人认为这种对比毫无意义，只有严格认清楚冷冻电镜不同研究对象的难度差异，才能有一个准确客观的评价。王祥喜博士等的HSV-2病毒结构研究堪称病毒结构研究的巅峰之作，甚至在某种意义上突破了传统冷冻电镜研究的极限。

一般而言，正二十面体病毒由于具有极高的对称性，是早期冷冻电镜结构研究中的典型代表，也是最早被解析到近原子分辨率的target。这些事实往往导致一些错误的观念，特别是刚开始了解冷冻电镜技术的初学者，往往认为“目标越大、对称性越高，则冷冻电镜结构研究越容易”。事实上，冷冻电镜研究对象的“尺寸”和“对称性”这两个因素都是双刃剑。（1）尺寸：在样品完全均一、稳定、没有过多柔性结构域等条件下，并且满足透射电镜成像的“弱相位近似”原则的情况下，的确是“尺寸越大，结构解析越容易”（这是因为结构信息丰富，图像匹配更加容易）。但是完整HSV-2病毒直径超过200nm，衣壳部分也超过120nm，如此巨大的目标会导致诸多冷冻电镜成像问题，比如样品形变、欠焦量随样品高度的变化、非弹性散射和多重散射等。这种情况下大尺寸反倒成了限制近原子分辨率结构研究的致命瓶颈。（2）对称性：“多次测量求平均值可以显著提高测量精度”，这几乎是一个常识性的原则。冷冻电镜中对称样品的结构测定通常也有效利用了一点，比如正二十面体病毒具有60重对称性，一个颗粒相当于60个非对称样品。但是“平均去噪”这个原则有一个默认条件，就是被平均的对象的数学期望必须严格一致。多种不同的信号之间相互平均导致的结果往往是致命的，甚至还不如带噪音的未平均的信号。对冷冻电镜结构研究而言，目标分辨率越高，这个要求就越严格。而HSV病毒恰恰就有那么一点不完美——总体轮廓呈现正二十面体对称性，而高分辨率信息逐渐违背对称性。

上述两个因素堪称超大病毒结构研究中致命的“分辨率屏障”。这导致一个奇怪的现象，在较低或中等目标分辨率时（比如5-8埃），大病毒结构研究比小的蛋白复合物容易得多；但随着目标分辨率的提高，病毒高分辨结构研究的难度突然急剧增加，似乎再好的电镜、再完美的探测器、再多的数据量都无济于事；反倒是小的样品随着数据量的增加，分辨率会不断被刷新。为了突破大病毒结构研究的分辨率极限，王祥喜博士等研究人员将病毒的每一个不对称单元划分为若干小区域，用自己开发的程序巧妙地精修每个小区域的空间取向，并根据空间取向和位置参数补偿欠焦量，然后将重构后的小区域拼接在一起并返回到完整病毒结构。这样的处理，不仅成功解决了准对称性问题，也提高了衬度传递函数矫正的精度。利用现有的程序Relion，同时按照传统的数据处理方法，王祥喜博士一开始仅获得4埃左右分辨率的密度图。这样的分辨率下，依然有许多残基无法成功定位或不完全确定，特别是衣壳的外周部分；而利用他们自己开发的程序进行局部取向优化和欠焦量补偿之后，分辨率提高到了3.1埃，显著好于前者，大幅度刷新了此类病毒研究的最高分辨率记录。

由于近些年冷冻电镜技术革命，目前来说一般结构解析的确比前些年容易许多，甚至正在常规化。这种局面下也导致许多外行人员对冷冻电镜领域存在诸多误解，以为随便一个生物样品，到高端电镜底下拍一些照片，随便跑一跑现有的程序，然后就能出好结果。而就在本文正式在线的前几天，bioRxiv在线了英国格拉斯哥大学病毒研究中心的一篇名为“Structure of the herpes-simplex virus portal-vertex”的预印版论文【6】。该研究团队使用了同级别仪器和相当数量的数据量，而分辨率仅6-7埃。这也从一个侧面反映了HSV病毒研究绝非常规对象，绝不能把它等同于一个普通的正二十面体病毒结构研究（注：此处完全没有取笑其他研究团队之意，仅仅只是举证表明该课题比一般人想象的要难得多）。

一个时代有一个时代的要求，冷冻电镜技术革命带来的必然结果并不是降低了门槛，而是对研究人员提出了更高的要求，要么是面向更加深刻和重要的生物学意义，要么是面向更加艰难和强大的技术突破，要么是二者的完美结合。我们甚至可以毫不夸张地说，这是王祥喜博士等中国研究人员一项非凡的成就，它把超大病毒冷冻电镜结构研究推向了一个新的高度；这也是多个研究团队联合攻关，发挥各自优势，共同突破重大难题的典范。

另，值得一提的是，Science杂志还发表了UCLA的Z. Hong Zhou实验室HSV-1的结构。

1. Davison, A. J. (2002). Evolution of the herpesviruses. Veterinary microbiology, 86(1-2), 69-88.

2. Arvin, A., Campadelli-Fiume, G., Mocarski, E., Moore, P. S., Roizman, B., Whitley, R., & Yamanishi, K. (Eds.). (2007). Human herpesviruses: biology, therapy, and immunoprophylaxis. Cambridge University Press.

3. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs400/zh/

4. Yu X, Jih J, Jiang J, et al. Atomic structure of the human cytomegalovirus capsid with its securing tegument layer of pp150[J]. Science, 2017, 356(6345):eaam6892.

5. Dai X, Gong D, Lim H, et al. Structure and mutagenesis reveal essential capsid protein interactions for KSHV replication.[J]. Nature, 2018.

6. McElwee, M., Vijayakrishnan, S., Rixon, F., & Bhella, D. (2018). Structure of the herpes-simplex virus portal-vertex. bioRxiv, 290544.

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