一作解读：当光遗传学结合双光子荧光显微成像应用于非人灵长类大脑皮层
近日，北京大学生命科学学院唐世明课题组于PLOS Biology在线发表题为“Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates”的文章。
该研究利用光遗传学和双光子荧光显微成像技术，首次报道了具有单细胞精度和长时程稳定性的全光学手段（AOI）在非人灵长类大脑皮层的成功应用案例。
接下来，本文第一作者、生命科学学院2015级博士研究生居年盛为您带来更为细致的解读。
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光遗传学
广义上来说，通过遗传学手段在特定类型神经元中表达效应器后利用光来改变神经元的活动被称为光遗传学。
微生物视蛋白作为一种光感蛋白，因其简单、高效和通用性高，成为目前最常用的光遗传学效应器。在特定波段光的照射下，视蛋白结构发生改变，便作为离子通道允许特定类型的离子跨膜流动，最终导致神经元膜电位的变更，从而引起对神经元的激活或抑制作用。
以当下影响最为深远、应用最广泛的视蛋白channelrhodopsin-2（ChR2） 为例，其自身作为一种阳离子通道，在蓝光的照射下通道打开使得钠离子内流、钾离子外流，导致膜电位去极化从而令神经元兴奋。
“光遗传学”这一专有名词于2006年被正式提出。
在至今十年多的时间里，具有高空间、时间分辨率的光遗传学手段被广泛应用于神经元群体和神经回路的功能研究。
同时，借助遗传学工具的发展，光遗传学可以实现对特定类型神经元的高效操控，极大促进了特定类型神经元的功能研究。
总的来说，这些手段对我们理解神经回路如何工作以及它们如何控制行为有着重要意义。
图 1
A. 兴奋性和抑制性光感蛋白（图片来自网络）；
B. ChR2的光控效果图 （引自Boyden et al., 2005 Nature Neuroscience） ；
C. 光遗传学应用于小鼠深脑核团的刺激（引自Scanziani et al., 2009 Nature）。
双光子荧光显微成像
双光子荧光显微成像技术是目前广泛使用的在体光学成像技术。当两个长波长光子被荧光团同时吸收，荧光分子由基态跃迁至激发态从而溢出荧光。双光子成像过程中，仅焦平面的光子密度足够激发荧光分子，因而无需针孔装置进行聚焦，使得成像质量相比于共聚焦显微镜有明显提升。
在近三十年的发展历程中，双光子成像技术不断成熟和完善。相比于传统的电生理记录手段，双光子成像可以实现在单细胞、单数突精度上对神经元群体活动的监控。受限于固定难度和遗传学差异，双光子成像的应用对象多为个体较小的实验动物，包括小鼠、树鼩、果蝇等。
本课题组经过多年的摸索和尝试，近期成功在清醒猕猴的大脑皮层实现高效、稳定的双光子成像（Li et al., 2017, Neuron）。
猕猴作为非人高等灵长类动物，同人有更高的同源性，在行为、大脑结构和功能上更为接近，对神经疾病和高等认知功能的研究有着重要的意义。
图 2
A. 双光子激活原理示意图（图片来自网络）；
B. 双光子成像下的猕猴初级视觉皮层朝向Pinwheel结构图（引自 Liet al., 2017, Neuron）；
C. 双光子成像与同步电生理记录（引自 Liet al., 2017, Neuron）；
D. 不同尺度上的双光子成像示意图（引自Scanziani et al., 2009 Nature）。
结合光遗传学和双光子成像的全光学手段（AOI）
AOI一方面利用光遗传学改变神经元的活动状态，另一方面通过钙指示剂和双光子成像同步记录神经元的活动，实现了以非侵入性损伤的方式实现对目标神经元群体的重复性操控和监视。
应用AOI可以对神经元群体进行重复性、低损伤的单细胞操作，推动着神经回路的精确功能测绘。
高效、高精度的AOI目前已被报道可以在小鼠的大脑皮层上实现（Rickgauer et al., 2014 Nature Neuroscience, Packer et al., 2015 Nature Method），但非人高等灵长类动物大脑皮层的AOI技术仍有空缺。
基于本实验室成熟的非人灵长类大脑皮层双光子成像平台（Li et al., 2017,Neuron），我们近日成功在猕猴初级视觉皮层进行高效、稳定的AOI操作并于PLOS Biology学术期刊在线报道。
本文报道了长时程、高效的AOI在猕猴大脑皮层的首次成功应用。
在攻克了阻碍单光子、双光子光遗传学刺激和双光子成像在清醒猕猴大脑皮层上结合应用的困难后，我们成功实现在长达6个月的时间内对同一神经元和神经元群体的稳定操控和记录。重复的光遗传学刺激在猕猴初级视觉皮层引起高度一致的神经元活动，并引起可靠的视觉感知。在本文行为学任务下，猕猴经由光遗传学获得的视觉感知与视觉刺激带来的感知相当。
本次进展对高等灵长类动物特有的神经回路机制的研究有积极帮助，同时为人类神经疾病的光遗传学治疗提供了临床前测试的重要参考。
单光子光遗传学操控和同步双光子成像
我们首先在猕猴初级视觉皮层（V1） 转染了光遗传学蛋白C1V1 和钙信号探针GCaMP5G/GCaMP6s。
经过6周时间的表达后，我们在皮层表面安装用于光激活和双光子成像的光学窗口。由于C1V1-ts-eYFP的膜定位特性，双光子成像下神经元胞体呈黑洞状。神经元静息状态下，GCaMP6s荧光相对较弱。
为检测光激活的效率，我们用532 nm的单光子激光对成像视野内的神经元群落进行重复激发。
在重复的激光照射下，各神经元的神经活动具有高度的一致性。与视觉刺激（移动光栅和颜色块）进行对比，同一神经元在视觉刺激和光激活下产生的神经活动幅度相当。
通过调整所用激光的光强，我们记录到强度低至0.8 mW/mm2的激光便足以引起高效的神经活动。
图3
A. 猕猴V1神经元在表达C1V1-ts-eYFP和 GCaMP6s后的双光子图像；
B. 视觉刺激下神经元群体的反应；
C. 光刺激下神经元群体的反应；
D. 两个示例神经元在光刺激和视觉刺激下的反应曲线；
E. 神经元群体在光刺激和视觉刺激下的反应强度对比；
F. 神经元群体在光激活下的重复性统计；
G. 神经元群体平均反应强度与激光强度的关系。
长时程稳定性
通过AOI，我们尝试评估转基因表达水平和神经元群体在光刺激和视觉刺激下反应强度的长时程稳定性。
实验结果显示，在长达6个月甚至更长的时间内，猕猴V1基因表达水平和光激活下神经元的反应维持稳定。
同时，经视觉刺激检验，V1神经元的反应特性在这段时间内不受影响，仍有着正常的生理特性。
图 4
A. V1脑区在转染后第204天（Day 204） 和第292天（Day 292） 的双光子图像；
B. 视觉刺激下Day158/Day 292神经元群体的反应；
C. 光刺激下Day158/Day 292示例神经元的反应曲线；
D. 视觉刺激下Day158/Day 292示例神经元的反应曲线；
E. 皮层不同深度的转染效果图；
F. 皮层不同深度神经元在光刺激下的反应强度；
G. 光激活实验中Day158/Day 292平均图像；
H. 光激活下Day158/Day 292神经元群体反应强度对比；
I. Day 158/Day 292神经元群体偏好朝向对比。
单细胞精度的光激活和同步双光子成像
解析神经回路功能的一个有效手段是在激活单个神经元情况下同步记录该神经元所连接神经元的活动。
为了实现同步的单细胞精度光激活和神经元群落双光子成像，我们在现有的光路中加入了另一路锁模飞秒激光（1070 nm, 50 fs），并通过双光子螺旋扫描来激活目标神经元。
为了检验单细胞双光子光激活的空间精度，我们以目标神经元为中心排列了5x5等间距分布（20 μm）的激活点阵，当且仅当螺旋扫描线位于目标神经元胞体处时，该神经元被激活。
进一步，我们同时瞄准一片成像区域内的多个目标神经元并按顺序进行光激活操作。每个目标神经元当且仅当在被双光子螺旋线瞄准时产生较强的反应。
图 5
A. 共表达GCaMP5G和C1V1的神经元和光激活点阵；
B. 双光子光激活下神经元的反应曲线；
C. 光激活位置在神经元胞体和四周的反应曲线对比；
D. 另三个示例神经元在双光子光激活下的反应曲线；
E. 多个共表达GCaMP5G和 C1V1的神经元和光激活点阵；
F. 双光子光激活下神经元的反应曲线；
G. E中目标神经元在双光子光激活下的反应曲线。
光遗传学对行为的操控
为评估光刺激V1神经元群体所引起的感知，我们设计了一个名为”GO”/”NO GO”的视觉感知任务。
在该任务中，猕猴需要用眼动来报告周边视野中短暂出现的视觉提示。
在”GO”实验中，我们首先用一个0.5度的高斯白点作为视觉提示，呈现在注视点周围三度左右的视野中。
猕猴首先盯住中心注视点开始实验，视觉提示在一段随机的时间段中出现，当且仅当猕猴在提示消失的500 ms时间内做出扫视动作方可得到果汁奖励。
在”NO GO” 实验中，无视觉提示出现，猕猴需要保持注视中心注视点2000 ms以得到果汁奖励。
经过训练，猕猴在该任务下有超过80%的正确率。而且，在没有要求眼动扫向提示区域的情况下，猕猴的眼动均一致导向提示出现区域。
我们接下来用光遗传学刺激代替视觉刺激进行相同的实验，即通过光激活V1脑区（1 mm2, Opto Stim）来检测猕猴是否能接收到视觉感知。
为了使实验更加严格，我们增加了一个严格的对照实验。在该对照中，我们将激光导向光学窗口中另一片未表达C1V1的脑区（Mistargeted Stim）。
经过一段适应期（<30 tirals）后，猕猴在Opto Stim下表现出高度一致的眼动响应，而且眼动导向的区域正是目标脑区在视觉拓扑投射下对应的视野区域。Mistargeted Stim下未表现出明显的眼动。
图 6
A. 行为学任务示意图；
B. 激光位置导向装置；
C. 行为任务正确率统计图；
D. 视觉刺激下的眼动轨迹统计图；
E. 光刺激下的眼动轨迹统计图。
接下来，我们对视觉刺激和光刺激下眼动的时间延迟做了统计分析。
实验结果显示，两只猕猴在光刺激下的眼动反应均比视觉刺激下的快了约30 ms。这一结果与早期研究中报道的视觉信号从视网膜传至初级视觉皮层所需的时间吻合。
综合这些行为学结果，光刺激能给猕猴带来与视觉刺激相当的感知，从而也印证了本研究中光遗传学激活手段的高效性。
1. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 2005; 8(9):1263–8.
2.Scanziani M, Häusser M. Electrophysiology in the age of light. Nature, 2009, 461(7266):930-939.
3. Li M, Liu F, Jiang H, Lee TS, Tang S. Long-Term Two-Photon Imaging in Awake Macaque Monkey. Neuron. 2017; 93(5):1049–57 e3.
4. Packer AM, Russell LE, Dalgleish HW, Hausser M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nat Methods. 2015; 12(2):140–6.
5. Rickgauer JP, Deisseroth K, Tank DW. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nat Neurosci. 2014; 17(12):1816–24.
6. Denk W, Strickler JH, Webb WW. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 1990; 248(4951):73–6.
7. Chen TW, Wardill TJ, Sun Y, Pulver SR, Renninger SL, Baohan A, et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 2013; 499(7458):295–300.
唐世明：
北京大学生命科学学院研究员、博士生导师
获第九届中国青年科技奖
入选新世纪“百千万人才工程”国家级人选
获国务院政府特殊津贴
研究成果入选“2005科学发展报告”（共10项突破性成果）
2005年获国家杰出青年科学基金
“科学中国人2004年度人物”
研究成果“果蝇的视觉不变性”入选2004年中国科学家十大发现
实验室研究领域:
研究背景：脑认知与人工智能
如果你想要理解大脑认知的原理、想要突破人工智能，或者说想要构建一个物理系统，使之能像大脑一样感知和思考，应该从哪里入手呢？
广义上讲，大脑是一个计算系统，它大概是由不太复杂但数量庞大的计算单元（神经元）组成的。虽然在发育关键期，外部刺激对大脑神经网络布线有重要影响，但外部刺激和学习记忆应该不是决定性的因素。
通过复杂的刺激训练，并不能使一个规模庞大、但结构简单的神经网络自动产生多少智能。事实上，亿万年缓慢的生物演化，使大脑具有复杂的网络初值，这应该才是智能的关键。
如果我们还没有能力设计出一种比自然演化更高效的算法，自动搜索出智能系统，也没有足够高的智慧或者足够好的运气，直接设定智能系统的初值，那么，从神经生理层面，研究真实大脑的神经线路，将是值得考虑的做法。
视觉认知：
最初级的智能起始于感觉系统，人脑信息输入有超过80%来自视觉，脑认知的内部运作也主要基于视觉概念。
视觉认知主要功能是识别，另一个则是空间定位，这对应于生理学上的What和Where通路。视觉系统的智能体现在视觉不变性，偏离注视点或者大小不同的同一个客体，均能被视觉系统准确快速地识别，而这些视觉客体在视网膜甚至是初级视皮层上的激活区都发生了很大的变化，这也是理解视觉识别的最大障碍之一。
知觉不变性对应了思维的基本元素——概念，进而也是大脑构建知识系统及产生智能的基石，就像是底层的操作系统和汇编语言，虽然艰涩难懂，但却是最终理解脑认知不能回避的问题。
研究方向：
1960年代Hubel和Wiesel的发现或许已经解答了一条简单的线段是如何被识别出来的，即：对于可能出现在各个位置的、不同朝向的线段，大脑都预制了对应的检测细胞。
这种简单策略在识别稍微复杂的图形的时候就会遇到困难，我们或许可以设想大脑预制了针对两条线段组合的细胞，那么三条线段或者更为复杂的图形又该怎么办呢？不幸的是，现实中的图形大多都比线段复杂，识别轮廓中局部线段的朝向，那只是个开始。
真正的挑战在于，视觉系统是如何利用这些分散的朝向信息，识别出一个完整的图形。
我们研究那些比bar稍微复杂一点的图形，例如一条比bar长一点的线段，是如何被大脑识别出来的，进而了解视觉认知最基本的原理。
为此，我们建立了先进的视觉认知行为和神经生理学实验平台，采用电极阵列、光学成像、分子生化、双光子等研究技术，探测视觉皮层复杂的神经线路，研究视觉系统如何同时产生形状识别的选择性和不变性。
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文字：居年盛
排版：湫翎