讲透了！PCR 引物设计成功的秘诀，全在这里了（值得收藏）

1. 目的片段的获取

设计引物取决于待扩增的目的片段。设计者在 NCBI 首页的搜索框的下拉菜单中选择 Gene,再在对话框中输入目的基因的名称；选择对应的来源之后，选择对应需要的亚型，将其编码基因的 CDS 区域保存。

2. 引物的设计

引物设计方法有很多种，原则也有千千万万，众多的软件可供选择。如用Oligo7 软件打开保存的序列，将光标拉至扩增序列的最前端，点击 Edit 。里面选择 Edit forward primer，系统默认 21 个碱基，按照 A/T*2+C/G*4 计算引物的 Tm 值，一般 Tm 值在 54-64℃ 之间，可根据这个范围调节引物的长度；调整完成之后将这段编辑后的序列按 5'-3' 的方向复制到 excel 表格中；同样的方法设计后引物并复制到 Excel 表格。

3. 引物的调整

按照质粒构建的方法，在前后引物的 5' 端加上酶切序列（T4 连接酶的方法）或 15-20 bp 的载体酶切位点附近的载体序列（同源重组的方法），按照载体上的酶切序列编码情况，还需要在前引物 ATG 起始前加入碱基以免编码错位，以及确认后引物是否需要终止密码子。

六、引物设计的注意事项

1. 注意正反向引物都是 5‘-3’ 的方向；

2. 注意前引物中可能存在错码的可能以及后引物的提前终止。

七、引物设计的常见问题

1. 引物设计错误，特别是没有注意后引物的方向；

2. 没有注意前引物的移码突变问题；

3. 没有注意后引物终止密码子的问题。

看了小编的讲解，科研新手心中是否有谱了呢？引物设计并不难，在于多总结多分析，在实际例子中积累经验。

当然，更快的方法，就是从其他人的问答中学习经验提前避坑！

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