半小时，讲清 WB 实验鉴定外泌体！（值得收藏）

一、外泌体是什么？

外泌体是直径约为 30-200nm，密度在 1.13-1.21g/mL 的小囊泡，其天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等。

Western Blot 鉴定外泌体蛋白可以检测膜蛋白（如 CD63、CD81、CD82、HLA、integrin 等），检测膜结合蛋白或外泌体游离蛋白（前者如 ALIX、TSG101，后者如 HSP70、ACT 等）。

二、实验材料与仪器

材料：外泌体样本、BCA 蛋白定量试剂盒、5 x SDS protein loading buffer、不同浓度 SDS page 胶、电泳液、转膜液、PVDF 膜、skim milk、TBST、抗体、发光液等；

设备耗材：EP 管、摇床、电泳仪、转膜仪、离心机、96 孔板、移液器、枪头、ECL 扫膜仪、酶标仪等

三、实验步骤

1. 蛋白浓度测定：

• 取标准品和稀释待测样品 25μL 加入到 96 孔板中；

• 取 200μL 的 BCA 工作液于 96 孔板中，37° 孵育 30 min；

• 多功能酶标仪测定 A562 的吸光度；

• 根据标准品测值绘制标准曲线，通过标曲计算出待测样品的蛋白浓度。

2. SDS-PAGE 凝胶制备：

篇幅限制，想要进一步了解凝胶制备的同学，可以点击图片千万具体内容查看哦~

3. 实验流程：

• 将样品原液稀释至所需的上样量，然后按照样本稀释液：loading buffer为 4:1 的比例加入 loading buffer。

• 充分混合后稍离心，95℃ 加热 5 min 后放于冰盒上待冷却后 4℃。

• 固定凝胶板到电泳装置内，外槽加入适量的 1×SDS 电泳缓冲液，内槽加入 1×SDS 电泳缓冲液至刚好淹没凝胶加样孔

• 拔出凝胶板中的梳子，待电泳也充满加样孔后， 将冰盒中的样品 12000×g 离心 5 min 后上样。80V 电压下电泳 30 min 至溴酚蓝染料浓缩胶进入分离胶后将电压调制 120V 继续电泳 60 min。

• 取 PVDF 膜在甲醇中活化 5 min，然后将膜与滤纸在缓冲液中平衡 15 min 后与 SDS-PAGE 电泳完成后取出的凝胶夹层放入加有转移液的实验盘内。

• 取出夹层中的凝胶，去除浓缩胶后的分离胶用 1× 转膜缓冲液漂洗一次。

• 以海绵→三层滤纸→分离胶+ PVDF 膜←三层滤纸←海绵的方式在转膜槽中 180 mA 转膜 2 h 。注意除去制样中产生的气泡，同时转膜过程中会产热，可将转膜槽外部置于冰上转膜。

• 将转膜后的 PVDF 膜置于 5% 脱脂奶粉的 TBST 的孵育盒中，室温脱色摇床上摇动封闭 1 h。

• 封闭完成后，将膜的蛋白面朝上置放于适当浓度的一抗稀释液中，4℃ 脱色摇床上摇动孵育过夜，室温下 TBST 摇动洗 3 次，每次 10 min。

• 对应二抗室温孵育 1~2h 后 TBST 摇动洗 3 次，每次 10 min。

• 将膜置放于成像仪中加入 ECL 发光液进行化学发光反应，拍照。

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