崩溃！WB 又要从头再来，踩坑无数的我总结了这 5 点

Western 实验一开始的「蛋白凝胶电泳」直接决定了 WB 条带的好坏，需要关注小窍门如下:

原因：样品降解了。

解决方案：提蛋白的时候应将样品放在冰上,并使用新鲜的裂解液。

解决方案：观察胶上染料「溴酚蓝」是否变黄，变黄说明发生「离子耗竭」, 需注意跑胶前清洗所有配件, 使用新鲜缓冲液, 重要的是确认电泳芯的夹子是否松了, 电泳槽漏缓冲液导致 pH 值变化造成条带跑歪。

梳子需缓慢从胶中拉出, 上样前必须轻柔拉直且吹净每个上样孔, 加样 Tip 头不要碰到上样孔底, 避免电泳条带失真。

微笑或皱眉条带导致常见原因：跑胶过程中积聚过多热量。

解决方案：降低电源设置减少热量累积, 槽中添加冰袋保持缓冲夜温度, 并确认每次都用新鲜的缓冲夜, 电泳过程中缓冲夜是否不足或缓慢泄漏。

不要过量上样, 确认样本中是否含有过量的盐/表面活性剂或有机溶剂, 必须在上样前稀释样品或用旋转离心柱清洁样品, 最后使用上样缓冲填充上样孔, 确保样本迁移均匀。

Bio-Rad 推荐大家使用 TGX 快速免染制胶试剂盒, 30 分钟制胶，电泳运行时间仅  20 分钟，无需压胶, 简化操作, 缩短时间, 提升结果的重复性。

完成凝胶电泳后，下一步就需要进行转膜,需要关注小窍门如下:

1）没有条带可能是电转移时蛋白从空隙中流走, 建议使用厚滤纸及合适的厚度的海绵,保证胶与膜之间有合适的紧贴程度,因为转印模块的海绵可能由于长期使用可能会变得很薄,在胶和膜之间形成潜在的间隙。

2）平衡你的膜,不要让它干了,尽量用镊子夹膜。

3）使用滚轮确保去除胶和膜之间的气泡。

4）务必使用全蛋白染色(如考马斯蓝), 或免染技术和快速免染胶技术直接来观察目标蛋白转移到膜上的转印效率。

Bio-Rad 推荐大家使用 Turbo 系统实现最快 3 分钟的转印, 转印不用再等。

完成转膜后，孵育时一抗和二抗的比例很关键, 需要关注小窍门如下:

1）选择一抗必须具有特异性,高亲和力,经过可重复的实验体系验证。

2）优化一抗孵育浓度条件:最佳抗体浓度是指没有背景或非特性反应下,产生专一性强阳性讯号的抗体稀释度。

3）优化孵育时间: 通常高表达目标蛋白, 在室温下孵育 1~2 小时就足够。如果目标蛋白丰度很低, 建议在 4℃ 孵育过夜能产生更佳效果。

4）避免孵育时间过长:可能导致更高背景和非特异性结合。

5）挑选优异的封闭液能有效提升阳性信号并且降低背景水平。

化学发光显影条带深度和显影时间相关，显影时间越长条带颜色越深，最好使用数字成像系统的自动优化曝光选项，以获得信噪比最佳的曝光图片。

实验对照的设置十分关键, 需要关注小窍门如下:

1）检测样品务必使用阴性/阳性对照。

2）阳性对照:可使用纯化后的过表达目标蛋白或裂解液。

3）阴性对照:可以选择仅包含二抗对照(无一抗孵育步骤) 或明确不表达目标蛋白的组织或细胞裂解物。

4）目标基因敲除的细胞裂解物是最佳的对照。

5）进行实验前请查阅文献,了解目标蛋白特性, 因需考虑是否使用诱导或抑制目标蛋白表达的生长因子/化合物先处理细胞。

最后，实验过程的条件选择也很重要，如电泳和转膜时的电压选择，低电压耗时长但条带整齐，印迹清晰；高电压耗时短但是条带不够整齐，转膜时伴随的高热可能会蛋白印迹进一步扭曲。常规的电泳条件有 180V-45 min 和 150V-60 min。转膜条件常用 300mA-60 min。不同分子量的蛋白必须选择不同浓度的凝胶，不同的用途选择不同的膜, 高分子量的蛋白质建议使用梯度胶, 因能让更大的蛋白质分离留置胶中允许更有效转印，这些都需要在实验前确定好。