实验室连环悬案：怎么都跑不对的 PCR，我怀疑有「人」害我

A：PCR 仪的热盖温度过低，液体都在盖上

B：小手一抖 PCR 管盖子没盖紧，蒸发了

C：实验室采购的 PCR 管质量太差，按紧了仍然蒸发

D：PCR 管热化了，盖子形变蒸发了

E：PCR 管内的液体变成蝴蝶飞走啦

F：有人针对我

A 正确。当热盖温度过低，PCR 程序温度高于它的时候，会导致液体蒸发到盖上；B、C、D 正确。PCR 管盖子没盖紧、质量过差难以盖紧或者加热导致的 PCR 管形变盖子翘起来也会导致液体蒸发掉。E 错误。这一看就不对，除了香妃和蚕宝宝其他东西都是变不成蝴蝶哒，实验出 bug 的时候不要开始幻想，请老老实实学习。选 F，那大概率是你想多了。

注意啦，跑 PCR 程序前一定要先确认热盖的温度高于 PCR 程序里各步骤的温度；购买 PCR 管的时候，一定要选择洁净度和密封性高的；阅读 PCR 仪说明书看机器适配的耗材范围。

A：引物设计的太菜

B：退火温度太低

C：PCR 循环次数过多

D：新的 PCR 管质量太差本身就不干净（为了省钱）

E：储存水的离心管重复利用（还是为了省钱）被污染了

F：讨厌你的人偷偷打开 PCR 仪器给你加了点料

 A 正确。小白们刚开始做 PCR 很容易因为引物设计的太烂，导致 PCR 跑出来有非特异条带；B 正确。引物有自己的最佳退火温度范围，如果低于这个温度可能会有非特异条带；C 正确，PCR 循环次数过多也是会出现的；D、E 正确。使用的 PCR 管洁净度不够或者使用二次利用的离心管储存水，可能会导致外源 DNA 污染。F 错误。你怎么还会选这个？你这个年龄段你怎么还会选这个？

优化你的引物设计和退火温度设置，掉过坑踩过雷的师兄师姐们就是实验室给你的馈赠，去请教，去学习引物设计软件网站。退火温度也可以通过梯度预实验来优化；一般 PCR 循环次数 25-30 次即可；使用洁净度更高的 PCR 耗材，储存母本液体时使用新的离心管，经费用在刀刃上，才能更省钱。如果你坚持认为 F 选项也不是没有可能，那实验之外要花点时间在你的人际关系管理上了。

A：你这模板降解了呐

B：你这模板量明显不够呐

C：Taq 酶具有 5’-3’ 外切酶活性，循环次数过多就对产物下手了

D：用的 PCR 管、储存水的离心管核酸酶污染

E：DNA 不想上班裂开了

A 正确。划重点，一定要保证模板的新鲜度，每年都有那么些个怨种同学用已经降解的样本做模板，这种情况 PCR 失败的不冤；B 正确。普通 PCR 15-20ng 的模板量已经足够，只要这么点就不要克扣给足量了啦；C 正确。如果使用了 Tap 酶，循环数过多，它的 5’-3’ 外切酶活性会把你的产物切切切；D 正确。所使用的的 PCR 管或者装母液的离心管有外源性核酸酶污染也会导致产物降解；E 错误。DNA：是谁不想上班裂开了我不说。

PCR 实验条件允许的话，可以先凝胶电泳鉴定一下模板，使用新鲜且足量的模板才能获得好的 PCR 结果；不要设置过多的循环数；选择质量更好的无核酸酶的 PCR 管以及使用全新的离心管储存母液。

A：分装前样品没有摇一摇

B：PCR 管开小差，传热又不积极又不均匀

C：凝胶电泳时上样量不一致

D：有些管中的样品在跑程序的时候摸鱼

A 正确。样品如果分装，未混匀肯定会导致结果不一致；B 正确。PCR 管传热低效、传热不均匀也会导致各管结果不一致；C 正确。凝胶电泳时上样量没有控制一致，跑出来亮度当然不一样啦。D 错误。但你实在认为对的话，怕样品摸鱼可以哄哄它，答应它发了文章的话就放它照片。

敲黑板！分装前一定要混匀；选择认真负责的 PCR 管，传热又高效又均匀的那种；上样要做到精准上样，要控制上样量一致，不要 loading 随便点一点、sample 3uL 5uL 随便整，拿出科研人的严谨来！