毒尖上绽放的玫瑰：箭毒蛙毒素

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导读

在古老的亚马逊热带雨林中，印第安人会小心翼翼的把色彩斑斓的箭毒蛙放在火堆上，然后将蛙皮上的浆液挤出，并涂抹到锋利的竹箭上，这种竹箭一旦射入动物体内，哪怕是轻微的擦伤，也会造成动物抽搐而死，而竹箭上的毒素就是箭毒蛙毒素（图1）。

（图1: 涂有箭毒蛙毒素的竹箭图片来源：影视作品《启示录》）

箭毒蛙毒素具有和叔胺相类似的刚性甾体结构，能够靶向的作用于电压门控的Na⁺通道，并且持续激活心肌细胞膜上的钠离子通道，钠离子不能被释放出来，结果就会导致心脏骤停。实验表明箭毒蛙毒素对于小鼠的半数致死量LD₅₀=2 μg/kg（最小致死剂量~0.04 μg），0.1 mg就足以杀死一名成年人，是迄今为止已知的最毒的天然毒素之一（图2）。

（图2: 金黄色的箭毒蛙图片来源：National Geographic）

钠离子通道的研究与多种疾病相关联，比如癫痫、心脏疾病和疼痛等，而箭毒蛙毒素是研究电压门控钠离子通道（Nav）受体作用机制最为理想的化学工具之一。据报道^[^1]，全世界箭毒蛙毒素的库存量少于170 mg，而需求量却超过了1 g。在2016年，“Gilead Science”生物制药公司和斯坦福大学Justin DuBois教授课题组合作完成了首例箭毒蛙毒素的合成，科学家们从商业原料出发，以锂卤交换、自由基串联反应等为关键步骤，总共24步反应最终得到2 mg箭毒蛙毒素(-)-BTX，这篇全合成也发表在Science。有意思的是，他们也得到了非天然的对映异构体 (+)-BTX，而这个异构体的生物作用与箭毒蛙毒素的效果却完全相反，它能够阻止钠离子通道的开放（图3）。

（图3: 箭毒蛙毒素(-)-BTX的全合成图片来源：Science）

在电压门控Na⁺通道上，BTX受体的α-亚基由四个重复域（D1-D4）组成，每个域都有六个跨膜片段（S1-S6），并且所有四个S6片段都参与了BTX结合相互作用（图4）。对于箭毒蛙毒素对于钠离子通道独特的作用，研究人员认为有以下几种因素^[^2]：1，BTX能将钠通道的激活阈值改变-30至-50 mV，以使Na⁺通道在静息膜电位下容易打开；2，BTX消除了Na⁺通道的快速和缓慢失活，从而导致Na⁺通道的开放持续达数分钟；3，BTX降低了单通道电导率，并改变了Na⁺通道的离子选择性。

（图4: rNav1.4 Na⁺通道中BTX的受体图片来源：PNAS）

对于如此高毒性的生物碱毒素，为什么毒蛙自身能够免疫呢？科学家们沿着毒蛙自身抵抗力的遗传线索，研究了24种树毛龙和其他6种青蛙物种在钠离子通道D1/S6和D4/S6区域靶向测序数据，他们发现P. terribilis蛙肌肉（与褐家鼠作对比）中的五个突变体发生了变异，分别是D1/S6（S429A、I433V和A445D）和D4/S6（V1583I和N1584T），其中三种突变体（I433V、A445D和V1583I）在各种毒蛙进化枝中独立地进化了多次，其他两个突变体（S429A和N1584T）在毒性最高的物种P. terribilis蛙中进化了一次（图5）。

（图5: P. terribilis蛙和褐家鼠的rNav1.4 Na +通道对比图图片来源：PNAS）

为了弄清楚是哪一个突变体在抗BTX中其主导作用，实验筛选了5个单独的突变体，即每个突变体都被一个突变的蛋白体取代。根据实验对BTX敏感的标准确定，除N1584T外，所有突变体均对BTX敏感。通过实验发现，单个突变体（S429A、I433V、A445D和V1583I）在多达1,500个重复脉冲过程中易于被5 μM溶度的 BTX改变，其中，在1500个脉冲后的维持电流达到峰值幅度的≥75％；同时，这些突变通道的激活阈值向左移动到-90至-100 mV左右。

（图6: 突变体残基rNav1.4 Na⁺通道的脉冲研究图片来源：PNAS）

那么为什么N1584T表现出异常的耐BTX的性质呢？实验表明，突变体上rNav1.4 Na⁺通道中的N1584残基对于BTX在电压门控Na⁺通道上的作用至关重要：丙氨酸（N1584A）或者赖氨酸取代（N1584K）的突变体可以使得rNav1.4 Na⁺通道变得完全抗BTX。这就是为什么P. terribilis蛙在野外生存时，即使它们身体含有~1.1毫克BTX/每个体，如此大量的BTX也不会将这些金色的毒蛙致死。

参考文献：

1, Asymmetric synthesis of batrachotoxin:Enantiomeric toxins show functional divergence against NaV. Science, 2016, 354, 865.

2, Single rat muscle Na⁺ channel mutation confers batrachotoxin autoresistance found in poison-dart frog Phyllobates terribilis. PNAS, 2017, 48, 8042–8046.

撰稿人：Caeser

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