潜在抗癌药物！高活性、生物可用的口服Axl激酶抑制剂的发现

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导读

近日，中科院上海药物研究所的段文虎研究员和艾菁研究员报道了一类基于嘧啶二酮结构的高活性、生物可用的口服II型Axl激酶抑制剂，可作为潜在的抗癌药物。

Axl是受体酪氨酸激酶TAM家族成员之一，Axl及其唯一激活配体Gas6介导的信号通路在细胞活动中发挥非常重要的作用，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡及免疫应答等。相关研究表明，Axl激酶的过表达存在于慢性粒细胞白血病、乳腺癌、肺癌和肝癌等多种癌症中，与癌细胞的增殖、存活、转移和侵袭等密切相关。研究还发现Axl过表达是导致患者对肿瘤化疗药物或靶向药物（如厄洛替尼和拉帕替尼）产生耐药性的重要原因之一。因此，研发靶向Axl激酶的小分子抑制剂具有重大意义，不仅能够抑制Axl激酶，还能够解决由Axl过表达导致的耐药问题。

相对于许多受体酪氨酸激酶抑制剂来说，针对Axl的激酶抑制剂的开发还处于早期阶段，大多数处于临床I/II期（图1）。目前研发的ATP竞争性Axl抑制剂可分为两类：I型抑制剂通过结合Axl的活性构象抑制Axl，而II型抑制剂则是结合Axl的非活性构象。尽管已经开发了不少Axl抑制剂，但大多数都是非选择性的，因此，研发靶向Axl的选择性抑制剂是目前的新方向。

图1 代表性Axl抑制剂。图片来源：J. Med. Chem.

由于目前尚未有II型抑制剂与Axl激酶结构域的共结晶结构图，同时作者发现Axl激酶结构域与Met激酶结构域具有高度同源性（图2 C），因此，作者基于II型Axl/Met抑制剂4与Met激酶结构域的结合模型（图2 A），发现II型Axl抑制剂的结构可能包含：“头部”，铰链结合区；“尾部”，包含双氢键结合受体片段及氨基苯氧基连接片段（图2 B）。基于上述研究，作者初步设计出II型Axl抑制剂9（图3）。

图2 （A）化合物4的结合模型（B）II型Axl抑制剂结构特点（C）Axl与Met激酶结构域序列图片来源：J. Med. Chem.

图3 化合物9的结构。图片来源：J. Med. Chem.

基于化合物9，作者采用杂交设计策略对“尾部”的双氢键结合受体片段进行了筛选（图 4）。引入乙氧基取代吡唑环和嘧啶-4-酮环分别得到化合物10a和10b，前者几乎失去了对Axl激酶的抑制活性，而后者的抑制活性却显著增强。在化合物9的基础上，作者在6′位引入甲基得到化合物10c，其活性急剧下降，将嘧啶-4-酮替换成嘧啶-2,4-二酮得到化合物10d，相比于化合物10b，其活性略有增加。基于活性更为优异的化合物10d，作者在其1′位分别引入甲基、乙基、异丙基和吡喃-4-甲基得到化合物10e-h，其中化合物10f和10g的抑制活性显著增加。接着，作者嘧啶-4-酮替换成其生物电子等排体1,2,4-三嗪-3,5-二酮得到化合物10i，发现其活性相比于10b，下降了近10倍。作者引入一系列稠合杂环得到化合物10j-n，只有化合物10l和10m的活性增加。其中化合物10g的活性最为优异，可以作为进一步结构优化的基础。

图4 “尾部”基团构效关系。图片来源：J. Med. Chem.

接下来，作者利用分子对接研究了化合物10g的结合模式（图5）。作者发现“尾部”双氢键结合受体片段占据了变构结合位点，与Lys567和Asp690残基形成两个氢键，异丙基与4-氟苯基占据了两个不同的疏水口袋；“头部”吡啶基团的N原子与Met623残基的NH形成关键的氢键相互作用；氨基苯氧基连接片段占据了疏水通道。基于这些发现，作者提出设想：（1）1-甲基吡唑片段并未与结合口袋形成强相互作用力，对其进行结构修饰可能能够增强范德华力，从而达到增强活性的目的；（2）疏水通道只能耐受小体积取代基；（3）Met623残基的羰基氧原子可作为氢键受体，在吡啶上引入新的氢键供体与其形成相互作用或许能够增强抑制活性。

图5 化合物10g结合模型。图片来源：J. Med. Chem.

基于对化合物10g结合模式的研究，作者考察了1-甲基吡唑环在吡啶环邻位取代以及苯环取代基对活性的影响（图6）。将1-甲基吡唑环引入到吡啶环邻位得到化合物11a，相比于间位取代化合物（10g），其活性显著增强（1.9 nM）。在化合物11a的基础上，分别在苯环R²和R³位置引入F得到化合物11b和11c，其中化合物11b的抑制活性明显增强（0.8 nM），而11c的活性略有下降（5.5 nM）。在R²位置引入氯原子、甲基和甲氧基得到化合物11d-11f，发现三个化合物的活性均显著下降。相比于单氟取代化合物11b，双氟取代化合物11g-11i的活性均出现不同程度的下降。

图6 连接片段的构效关系。图片来源：J. Med. Chem.

基于先前的筛选优化，作者又考察了吡唑环取代基对活性的影响（图7）。在化合物11b的基础上，在R⁵位置上引入甲基得到化合物12a，其Axl抑制活性下降了近32倍，但其细胞活性却略有增加。相比于化合物11b，在R⁶位置引入大体积取代基得到化合物12b-d，它们的激酶活性和细胞活性均有不同程度的降低。根据“杂原子释放”观点，作者推测化合物11b的R⁶位的甲基可能代谢不稳定，因此作者脱除甲基得到化合物12e，发现其Axl激酶抑制活性略有下降，但细胞活性却显著增加（IC₅₀ < 0.2 nM）。

图7 吡唑片段的构效关系。图片来源：J. Med. Chem.

最后，作者尝试在吡啶环邻位引入氢键供体片段来研究活性的变化（图8）。将吡唑环替换成酰胺，并在R⁷位引入甲基、乙基、环丙基、环丁基、吡咯烷-1-基和吗啉基得到化合物13a-13f，发现其Axl激酶抑制活性和细胞活性均有不同程度的增加。然后，作者对活性最佳的化合物13c进行了分子对接（图9），发现其在铰链区与Met623残基形成了双齿氢键，这也就解释了为何其活性如此优异。

图8 化合物13a-e的Axl激酶抑制活性。图片来源：J. Med. Chem.

图9 化合物13c分子对接模型图。图片来源：J. Med. Chem.

基于化合物12e和13c的激酶活性和细胞活性，作者对其进行了初步的大鼠PK性质研究（图10）。如图所示，两个化合物均表现出优异的峰浓度（C_max）和口服暴露量（AUC₀_-_∞），但相比于化合物13c，化合物12e的半衰期更长（T_1/2= 18.2 h），可能存在潜在的毒性问题。随后，作者对化合物13c进行了小鼠PK性质研究（图11），发现其具有优异的口服PK性质，其半衰期（T_1/2）为5.20 h，峰浓度（C_max）为 2990 ng/ml，血浆药物暴露量（AUC_0−∞）为 25106 h*ng/ml，口服生物利用度（F）为 114.4%。

图10 化合物12e与13c的大鼠PK性质。图片来源：J. Med. Chem.

图11 化合物13c的小鼠PK性质。图片来源：J. Med. Chem.

基于上述实验，作者评估了化合物13c对多种激酶的选择性（图12）。从表中可以看出，化合物13c表现出优异的的选择性，不仅能够抑制Axl，还对Met、Mer和Tyro3具有良好抑制作用，而对其余38种酪氨酸激酶没有明显的抑制作用。表明化合物13c具有成为TAM和Met双抑制剂的潜力。

图12 化合物13c的激酶选择性。图片来源：J. Med. Chem.

作者又进一步研究了化合物13c对细胞内Axl和Met介导信号通路的影响。首先，作者发现在功能获得模型细胞BaF3/TEL-AXL中，化合物13c能够有效抑制Axl及其下游信号因子Akt的磷酸化（图13A）。而在非小细胞肺癌细胞NCI-H1299中，化合物13c同样能够有效抑制由Gas6诱导上调的Axl和Akt的磷酸化（图13B）。接着，作者考察了化合物13c是否有效抑制MKN45和EBC-1细胞中Met介导的信号通路，结果显示，化合物13c以剂量依赖的方式抑制Met及其下游信号因子ERK和Akt的磷酸化（图13C,D）。

图13 化合物13c对Axl和Met介导信号通路的影响。图片来源：J. Med. Chem.

为了进一步验证化合物13c能够选择性抑制Met突变细胞增殖，作者选择了Met扩增驱动的EBC-1和MKN45细胞（图14）。结果显示，化合物13c能有效抑制MKN45细胞和EBC-1细胞的增殖（IC₅₀= 64.0±5.4 ; 106.8±19.4 nM），而对于没有Axl和Met突变的细胞系，化合物13c几乎没有抑制活性（IC₅₀ > 10 μM）。

图14 化合物13c的细胞抑制选择性。图片来源：J. Med. Chem.

作者又对化合物13c对Gas6/Axl介导肿瘤细胞的迁移与侵袭的影响进行研究（图15）。在NCI-H1299和SNU449细胞中，化合物13c能够有效抑制由Gas6累积诱导的肿瘤细胞迁移和侵袭，且抑制活性显著强于BGB324。

图15 化合物13c对细胞迁移与侵袭的影响。图片来源：J. Med. Chem.

最后，作者考察了化合物13c的体内抗肿瘤活性（图16）。在BaF3/TEL-AXL移植肿瘤模型中，化合物13c能够有效抑制肿瘤生长，其肿瘤生长抑制率在5 mg/Kg剂量下可达105.9%，甚至与50 mg/Kg剂量的BGB324的抑制作用相当。在Met突变驱动的U87MG移植模型中，化合物13c能以剂量依赖方式抑制肿瘤的生长，并且能够耐受100 mg/Kg的剂量。

图16 化合物13c的肿瘤生长抑制。图片来源：J. Med. Chem.

小结：近年来，Axl激酶作为新颖的肿瘤治疗靶点已经受到了药物化学家的广泛关注。介于Axl激酶抑制剂在多种癌症的生长、扩散和耐药机制中的突出作用，越来越多的Axl激酶抑制剂出现在临床前研究或已经进入临床研究。而随着对Axl激酶的深入研究，未来或许会有更多高效和高选择性的药物进入市场，为癌症患者提供新的治疗选择。

参考文献：

[1]Varnum, B. C.; Young, C.; Elliott, G.; et al. Axl receptor tyrosine kinase stimulated by the vitamin-K-dependent protein encoded by growth-arrest-specific gene 6. Nature, 1995, 373, 623-626.

[2]Myers, S. H.; Brunton, V. G.; Unciti-Broceta, A. Axl Inhibitors in cancer: a medicinal chemistry perspective. J. Med. Chem. 2016, 59, 3593-3608.

[3]Rankin, E. B.; Fuh, K. C.; Taylor, T. E. Axl is an essential factor and therapeutic target for metastatic ovarian cancer. Cancer Res. 2010, 70, 7570-7579.

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c02093

撰稿人：Effie小迷弟

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