1. 前言
在做miRNA相关的实验时，最终都要做到miRNA的靶基因上时，有时候还要涉及miRNA靶基因的功能实验，这个时候有就可能用到RNAi技术，或者是说纯粹地研究某个基因的功能，也可以使用RNAi技术。RNAi的实现手段通常是两种，一种是直接买siRNA寡核苷酸片段，转染到靶细胞中；另外一种是利用shRNA慢病毒载体构建稳转的细胞系，shRNA在细胞中被加工为siRNA，进而发挥RNAi作用。
2. 常见shRNA载体
现在shRNA最经典的载体就是Sigma的pLKO.1-puro，货号是SHC001，在Sigma官网上查了一下，其实还有另外一种载体，叫TCR2-pLKO.5-puro，货号为SHC002，这两者的区别就在于pLKO.5-puro比pLKO.1-puro多了一个WPRE元件，WPRE元件增强了慢病毒递送的转基因的表达，这两个载体的其他部分完全相同，这两个载体的图谱如下所示：
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pLKO.1-puro载体带有嘌呤霉素筛选标记，也就是名称中的puro，因此可以使用嘌呤霉素来进行筛选。Sigma公司自身也有shRNA文库，有各种基因的shRNA载体，如果不想自己设计，也可以直接购买。原始pLKO.1-puro质粒的长度为7052bp，也是没有插入任何shRNA片段的质粒，当插入shRNA片段后，pLKO.1-puro质粒的长度为7,086 bp，插入的shRNA片段两端的酶切位点是AgeI和EcoRI，此载体插入片段的示意图如下所示：
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从上图可以知道，设计shRNA慢病毒载体的关键就是中间的茎环部分。
3.shRNA片段的设计
我们以文献中的某个基因为例说明一下如何构建shRNA，就以下面的这篇文献为例进行说明，文献信息如下所示：
Hoshika Y ,Takahashi F , Togo S , et al. Haploinsufficiency of the folliculin gene leadsto impaired functions of lung fibroblasts in patients with Birt-Hogg–Dubésyndrome[J]. Physiological Reports, 2016, 4(21):e13025.
此文献中使用的就Sigma的pLKO-puro载体，敲减的基因是FLCN，靶细胞是HFL1，即人胚肺成纤维细胞，现在我们以这个FLCN这个基因为例，说明一下如何使用Sigma的官网来设计shRNA。
我们在Sigma官网上查询相应的shRNA，输入网址：
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html
如下所示：
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点击Search，出现以下界面：
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单击FLCN，出现有关FLCN的各种信息，下拉滚动条，找到shRNA相关的信息，找人源的，如下所示：
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单击右侧的价格二字，会出现有关FLCN这个基因的shRNA序列，如下所示：
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如果序列中出现上述红色方框中的VALIDATED字样，说明此序列已经被验证过了，就可以直接使用，此文献中使用了前两条shRNA序列，之所使用两条shRNA序列，这是因为shRNA经过加工后形成的siRNA有一定脱靶效应，因此不少文献中都使用两条shRNA。
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我们以第1条序列，也就是以下的这一条序列为例说明一下它的构建原理以及如何连接到pLKO-puro载体上。
序列如下：
CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATCTTTTTG
此时将这个序列中的各个部分标出来，如下所示：
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从上面的图上我们可以看出，中间的红色部分就是最终形成茎环的部分，左侧的蓝色部分序列是CCGG，与右侧的绿色部分是TTTTTG，这两个序列都是与pLKO-puro载体连接的部分，其中CCGG是AgeI酶切位点的粘性末端，TTTTTG则是保证了shRNA转录出来后，其末端是连续的4个U，即UUUU。蓝色与红色部分的黑色字母标注的部分则是与FLCN的CDS互补的序列。
所有由pLK-puro这个载体构建的shRNA载体的这两部分都是一样的，其中蓝色与红色之间的这一部分是21个nt，红色与绿色这一部分也是21个nt，它们是互补的，公式就是下面的这个样子（从左到右，是5’到3’）：
CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bpantisense—TTTTTG 3
按照它转录出来，形成的茎环结构如下所示：
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第1条链基本上都可以在Sigma的官网上查到，现在我们设计第1条shRNA的反义链序列，前面提到，pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点是AgeI与EcoRI，因此在设计反义链的时候，需要添加上EcoRI的酶切位点的粘性末端，如下所示：
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将上面的反义链顺序按照5’到3‘排列就是下面的这个样子：
AATTCAAAAAGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATC，
它的公式为：
AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—3
因此，最终需要合成的序列就是这两条:
第一条（Sigma官网提供）：CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATCTTTTTG
第二条（自己设计）：AATTCAAAAAGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATC
虽然设计完靶基因的shRNA片段后，但是在后续的实验中，还需要有相应的对照，根据Sigma提供的信息以及文献中的内容，对照通常要做两个，一个是空载体，也就是没有插入shRNA片段的pLKO载体，另外一个就是含有一个没有靶向任何基因的shRNA的载体（sigma官网的货号是SHC002）,但是网上也能查到载体中的这段序列，如下所示：，
CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG。在构建shRNA慢病毒载体时，就可以使用这个shRNA片段来作为阴性对照。
参考资料
https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/trc-shrna-products/shrna-controls.html