CRISPR-Cas12a赋能的电化学生物传感器用于快速和超灵敏检测 SARS-CoV-2 德尔塔变异株

最近，CRISPR-Cas系统开始被应用在核酸检测中，由于它具有同时切割靶向核酸和非靶向核酸(用作报告分子)并输出信号的特性，在新型生物传感器构建中表现出了巨大的潜力。同时，电化学分析方法具有的高灵敏度、快速响应和成本效益优势使电化学生物传感器成为医学诊断中强大的分析工具。因此，本研究开发了一种基于CRISPR-Cas系统的新型电化学生物传感器，称为MoECS(Methodology of Electrochemical CRISPR Sensing)，用于检测SARS-CoV-2变异株。

CRISPR-Cas12a-Empowered Electrochemical Biosensor for Rapid and Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Delta Variant

Chenshuo Wu, Zhi Chen,* Chaozhou Li, Yabin Hao, Yuxuan Tang, Yuxuan Yuan, Luxiao Chai, Taojian Fan, Jiangtian Yu, Xiaopeng Ma, Omar A. Al-Hartomy, S. Wageh, Abdullah G. Al-Sehemi, Zhiguang Luo, Yaqing He, Jingfeng Li,* Zhongjian Xie,* Han Zhang*

Nano-Micro Letters (2022)14: 159

https://doi.org/10.1007/s40820‑022‑00888‑4

1. 以与 SARS-CoV-2 Delta S基因序列相同的 DNA 模板为模型，传感器可以在无扩增实验的情况下实现50 fM的检测限和100 fM至10 nM的检测区间，同时也具有高特异性和稳定性。

2. 设计的特异性crRNA可以匹配SARS-CoV-2 德尔塔变异株核酸序列上的突变位点，为诊断其它新出现的SARS-CoV-2变体提供了借鉴。

3.基于无线微型电化学平台，所构建的传感器在即时检测(POCT)中显示出良好的应用前景。

首先将MB-ssDNA报告基因固定于修饰电极表面。基于靶标的前间区序列邻近基序（PAM）以及靶标DNA与crRNA的互补性，设计了导向Cas12a/crRNA双链体，以特异性识别SARS-COV-2的靶标DNA。在没有目标DNA的情况下，Cas12a-crRNA的切割活性未被激活，MB-ssDNA报告分子保留在修饰电极表面，从而产生了明显的MB电化学信号。在靶标DNA存在的情况下，Cas 蛋白识别 PAM 序列，Cas12a的反式切割活性被激活，因此MB-ssDNA报告基因被从电极表面非特异性切割，导致MB的电化学信号降低。得益于金纳米颗粒的大比表面积，可以将目标识别事件转化为电极上ssDNA报告基因的大量切割，用于设计高灵敏度的电化学核酸生物传感器。

图1. 金纳米颗粒辅助CRISPR电化学生物传感器的原理示意图。

图3. (A)电化学阻抗谱 (EIS)表征；(B)方波伏安 (SWV) 曲线；(C)不同浓度靶DNA的 SWV曲线；(D)电流变化 (ΔI%) 与目标 DNA 浓度的对数之间的线性关系。

IV CRISPR电化学生物传感器的特异性探究

如图4所示，当靶标DNA被来自原始SARS-CoV-2病毒的核酸取代时，观察到明显降低的ΔI%(16.1%)，这证实了crRNA靶向Delta变体的特异性。此外，MERS、H₁N₁、H₃N₂、B型流感和HRSV均表现出不明显的信号变化(△I%<10%)，而仅来自Delta变体的靶标DNA表现出显著的电化学响应(ΔI%=77.9%)。该实验结果表明建立的电化学生物传感器能够以高特异性检测SARS-COV-2 Delta变体。

V CRISPR电化学生物传感器的即时检测应用探究

微型电化学工作站由智能手机连接直接控制，实验数据可通过蓝牙及时传输。迄今为止，丝网印刷技术对于SPE的制备已经成熟，因此SPE成本非常低。POCT检测中靶标DNA的浓度选择为10 nM，以证明POCT微电化学工作站检测SARS-COV-2变异株的可行性。如图5所示，从SWV曲线得到的 MB 的氧化还原峰电流分别为933.05 nA(不含靶标DNA)和280.11 nA(含靶标DNA)，ΔI% 计算为 69.97%，与从传统电化学工作站获得的相应ΔI%相比仅10%的差异。显然，MoECS结合微型电化学平台可用于POCT进行快速SARS-CoV-2 Delta变体的诊断，无需繁琐的样品处理。