追问顶刊 | 独家专访《科学》最新研究：老年为何出现睡眠碎片化？

# 追问按

李世斌：首先感谢TCCI天桥脑科学研究院安排这次采访！今天我们将要探讨的研究是我在斯坦福大学路易斯·德莱西（Luis de Lecea）教授实验室做博士后期间的研究课题。

早在二十多年前，德莱西博士在位于美国圣地亚哥的Scripps研究所J Gregor Sutcliffe实验室做博士后期间，在检测一种大鼠下丘脑特异性mRNA时发现这种mRNA编码一种神经肽前体。这种神经肽可裂解为神经递质下丘脑泌素1 (hypocretin1/Hcrt1)和下丘脑泌素2 (hypocretin2/Hcrt2)。由于分泌Hcrt的神经元具有下丘脑（hypothalamus）分布特异性，且与肠道激素分泌素（gut hormone secretin）氨基酸大量同源，所以我导师所在的团队将它命名为下丘脑泌素。

几乎同时，德克萨斯西南医学中心的一个研究团队（Takeshi Sakurai和Masashi Yanagisawa）也独立地发现了这个系统。他们在下丘脑外侧发现了两种可以结合G蛋白偶联受体的神经肽。他们发现将这些神经肽注入大鼠的脑袋里时，可以刺激大鼠进食，因此将这些神经肽命名为食欲素A (orexin-A)和食欲素B (orexin-B)。

神经科学研究技术的进步，特别是光遗传学(optogenetics)的发明，使得特定地调节某一类神经元活动并同步观察行为学上表型成为可能。2007年，德莱西教授和斯坦福大学Karl Deisseroth教授合作，发现激活这些神经元引起的一个主要的行为学上的改变是促进睡眠-觉醒转化和维持觉醒状态，即这些神经元的活动具有促觉醒作用。这些观察也印证了I型发作性睡病(narcolepsy type I)是由Hcrt神经元丢失所导致的。

我的研究兴趣主要是睡眠调控，特别是睡眠障碍的产生机制。众所周知，优质且充足的睡眠对于维持身心健康及生活质量有着至关重要的作用。然而，优质的睡眠面临着各种各样的挑战。比如伴随着衰老过程，睡眠质量会降低，而且睡眠质量下降不仅表现为白天犯困，或是晚上入睡困难，更多的是睡眠过程中容易短暂醒来，即晚上容易多次起夜，这些都严重影响了睡眠质量。我的研究方向之一就是伴随衰老的睡眠失稳，也就是睡眠碎片化现象。

李世斌：我们这篇文章探讨的科学问题是“睡眠碎片化”（sleep fragmentation）背后的机制是什么。

首先，通过比较年轻和年老小鼠的睡眠特征，我们发现年老小鼠有着更加频繁的睡眠-觉醒转换，也就是睡眠碎片化现象。这提示了，睡眠碎片化可能在不同物种间有着相似的保守神经机制。那么，是什么原因导致了这一现象呢？我们开始着手筛选一些激活后具有促进睡眠-觉醒转换功能的神经核团。我们使用光纤光度（fiber-photometry）记录特定类型神经元的活动，记录在睡眠-觉醒过程中它们的自发性活动。我们重点记录了自然状态下Hcrt神经元、腹侧被盖区多巴胺能神经元以及蓝斑核去甲肾上腺素能神经元在睡眠觉醒周期中的活动特点。相较于其他两类神经元，Hcrt神经元的活动特异性地与觉醒相关，即Hcrt神经元的自发性活动总是伴随着觉醒，所以我们重点比较了Hcrt神经元在年轻和年老组小鼠睡眠周期中活动特点的差异。我们发现年老小鼠Hcrt神经元放电活动更为频繁，导致更加频繁的觉醒活动，使得睡眠片段持续时间变短，也就是睡眠的碎片化。

在2004年到2007年间，随着光遗传学技术的出现，科学家可以更好地研究大脑里特定类型神经元活动与行为层面表型的因果关系。使用光遗传学技术，我们发现年老以及年轻小鼠的Hcrt神经元被激活后，相同的刺激让年老小鼠觉醒维持时间更长。我们觉得这个现象非常有意思。此外，我们对小鼠大脑里表达光敏离子通道蛋白（channelrhodopsin-2, ChR2）的Hcrt神经元进行定量分析，结果发现年老小鼠中表达ChR2的Hcrt神经元数量更少。于是，我们进一步做了电生理实验，在体外做了全细胞膜片钳记录，比较了包括膜电位、动作电位的阈值（firing threshold）等在内的一些电生理特性。我们发现年老小鼠的Hcrt神经元的静息电位有一定程度的去极化，更接近神经元动作电位的阈值，更容易放电。

那么，又是什么原因让年老小鼠hcrt神经元的膜电位产生去极化呢？我们猜测可能是年老小鼠Hcrt神经元的复极化电流减弱导致了这一现象。我们进一步比较了年老组与年轻组Hcrt神经元中电压门控钾离子通道（KCNQs）介导的M电流，这个电流是由KCNQ2/3将钾离子从细胞内泵到细胞外时产生的，因此在神经元膜电位复极化过程中具有重要作用。我们发现年老组的M电流幅度更小。我们还使用了高分辨率阵列断层扫描成像技术对KCNQ亚型在Hcrt神经元中的表达进行了定量分析，发现KCNQ2在年老Hcrt神经元里表达密度小于年轻组。因此，从解剖学角度佐证了功能学上发现的M电流减小的现象。

我们用基因编辑工具进行验证，发现当年轻小鼠Hcrt神经元中Kcnq2/3基因被破坏后，它们也会出现睡眠碎片化现象。总的来说，这项研究阐明了老龄化过程中出现睡眠碎片化的一个机制。

▷ 李世斌博士所在团队发表在《科学》上的文章

李世斌：概括地说，Hcrt神经元在放电时有促觉醒和维持觉醒的作用。举一个直观的例子，临床上有一种睡眠疾病叫做发作性睡病（narcolepsy）。它分为两种类型，对于罹患I型的病人，研究发现他们的大脑中缺乏Hcrt神经元，不管这是由遗传因素，还是其他因素导致的。由此可以看出，Hcrt神经元对维持合适的觉醒是至关重要的。没有这种神经元的话，当个体受到强烈的情感刺激时，比如高兴或者悲伤，他们很容易突然间没有办法控制自己而昏倒。这个状态像睡眠，但实际上不是睡眠，他们是有意识的。另外，研究发现患有发作性睡病的犬类是由编码Hcrt 2型受体基因突变所造成的。所以Hcrt系统最重要的作用是促进和维持正常的觉醒。

李世斌：这个问题非常好，我在做报告的时候，一些听众也问过这个问题。实际上，年老小鼠的Hcrt神经元最大的一个变化是其兴奋性提高了。为什么它的兴奋性会提高，其中一个原因可能是存在补偿性机制。换句话说，在衰老的过程中，Hcrt神经元开始丢失，剩下的神经元为了维持它原有的功能，需要提高它在整个控制睡眠觉醒过程中功能的比重，一个可能的办法是通过增加自身的放电频率，补偿性地提高兴奋性。另外一个可能原因是单个Hcrt神经元分泌的神经递质的量有所增加。我们的单核RNA测序结果显示，年老组Hcrt神经元的prepro-Hcrt mRNA的平均表达水平是年轻组的两倍左右。因此，在单个神经元层面，Hcrt神经元可能补偿性地分泌了更多的神经递质。这些都是一些可能的机制，需要进一步深入研究。

我还想提一点，在做这项研究的时候，我们也分析了蓝斑核去甲肾上腺素能神经元，它是Hcrt神经元一个主要的下游神经元核团。这群被Hcrt神经元直接“支配”的神经元的膜电位也发生了一定程度的去极化。所以我们推测在衰老过程中，不光是Hcrt神经元受到影响，其他相关的具有促觉醒作用的神经元也出现了类似的变化。这导致了在睡眠觉醒控制过程中，这些神经元对兴奋性刺激更为敏感，反应更为强烈。换句话说，相较于年轻大脑，年老大脑的状态变得更加不稳定。

▷ 过度兴奋的Hcrt神经元导致年老小鼠睡眠不稳定。图片来源：Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging

李世斌：为了模拟我们在体内做的实验，我们用了串状蓝光刺激，用了不同强度、不同频率的蓝光刺激年老和年轻组表达ChR2的Hcrt神经元，然后比较了第一个动作电位和最后一个。其实，最后一个动作电位可能已经不是一个标准的动作电位，因为它的起始端没有完全地回到静息电位水平。我们实际上比较的是它放电幅度差（amplitude difference）。就像您刚才所说的，在年轻的小鼠Hcrt神经元里，它的放电幅度减少得比较多。这其中的机制可能是，与年老小鼠相比，年轻小鼠Hcrt神经元动作电位的复极化过程更具鲁棒性，也就是说这个过程中年轻神经元的复极化功能良好，所以给予它一个刺激，产生动作电位，动作电位复极化过程中钾离子电流能有效地被激活，因此年轻Hcrt神经元的复极化更加显著。而年老组的Hcrt神经元放电活动中最后一个脉冲尖峰和第一个比，它的减少没有年轻组的多。

李世斌：前面提到的光遗传学实验，我们在年轻和年老Hcrt神经元中都是人为表达ChR2，尽管我们没有对ChR2表达量进行定量分析，但是我们注射的病毒浓度以及打的量，都是一样的，我们认为在光遗传学激活神经元的过程中，主要的作用肯定都是ChR2介导的，同样的光遗传刺激在年轻和年老Hcrt神经元中都可以成功引发动作电位发放。然而在动作电位复极化的过程中，如果有非常强的复极化电流的话，就可以很快地让Hcrt神经元回到静息电位。而年老组的Hcrt神经元，由于它的这种复极化电流减弱了，或者更具体地来说，介导这些复极化电流的离子通道受到损伤了或者表达减少了，那么就会导致它这个过程变慢，或者介导的电流变小，也就是复极化能力减弱，所以静息电位会维持在一个比较高的状态，也就是说更加去极化的状态。

李世斌：刚刚提到的ChR2的表达是一方面的证据，可能会有人说年轻组和年老组细胞状态不一样，因此表达ChR2的量不同导致了这些差异。我们还做了另外一个对照实验，用一个没有偏差方法，就是给年老和年轻的Hcrt神经元打电流，通过植入电极，分别给予两组相同的电流刺激。

将这种连续的电流打进小鼠的Hcrt神经元，在注射电流时，它所产生的动作电位是不能回到标准的静息状态的，因为电流是持续打进去。所以，它会产生一些棘峰电位（spikelets）。我们发现同样的电流打进去，年老组的Hcrt神经元会产生更多的spikelets，所以这说明年老的Hcrt神经元具有高兴奋性。

李世斌：刚才我们说到年老的Hcrt神经元更容易兴奋，那么接下来的问题就是分析什么原因导致的高兴奋性。我们想到，根据Hodgkin-Huxley模型，在神经元复极化过程中，钾离子通道扮演着一个非常重要的作用。我们选择了电压门控钾离子通道亚型KCNQ2/3介导的M电流，它在控制神经元阈下兴奋性、复极化，维持细胞的静息状态的过程中起着重要作用。这样的作用不只适用于Hcrt神经元，而是对所有表达KCNQ2/3通道的细胞都适用。我们选择具有复极化功能的M电流来重点研究年老Hcrt神经元兴奋性提高的原理。

首先，我们比较了年轻组和年老组M电流的大小，我们发现在年老的Hcrt神经元里，M电流的幅度是更小的，从功能方面验证了年老Hcrt神经元复极化过程的离子通道受损。然后，我们从形态学角度分析，使用高分辨率阵列断层扫描成像技术观察年老组与年轻组Hcrt神经元表达KCNQ亚型的不同，发现KCNQ2在年老Hcrt神经元里表达密度小于年轻组，因此从解剖学的角度佐证了功能学上的发现。

李世斌：其实我们这部分工作主要是想验证上述所发现的一些神经机制，就是大脑在衰老的过程中，它对睡眠的控制不像年轻时那么好了。当然我们也很期待随着研究的更加深入，未来可以开发出一些副作用更小的药物。

氟吡汀之前在欧洲上市过，主要用于治疗疼痛，属于非鸦片类的一个镇痛剂，但是后来发现这个药具有肝毒性，所以欧洲药品管理局（European Medicines Agency)于2018年撤销了其使用许可。此外，这个药在使用的过程中，临床上发现它的主要副作用之一是嗜睡，病人用完这个药后，疼痛会减轻，但是也会打瞌睡。

因此我们这项工作也解释了为什么使用这个药的病人有嗜睡的现象。但是这个药有没有可能用于临床提高老年人的睡眠质量？

这个问题，基于我们所理解的睡眠碎片化的神经机制，我觉得是有可能的。不过，还需要做很多的工作去优化这个药物，或开发新的具有相似作用机制的药物，如果可以发现一些更具靶向性的治疗靶点的话，效果可能会更加理想。

李世斌：这是一个很好的问题。基础研究的最终目的是为了医治疾病，提高人的生活质量。最近注意到已经有科学家进行了这方面的尝试。去年在Nature Medicine上发表的一项研究显示光遗传学治疗在色素性视网膜炎导致的失明病人中部分恢复了视力。当然，这项技术目前还是一种侵入式的研究手段，对实验个体是有创伤的。所以目前看起来，还有比较多的挑战和工作需要攻克和完成，还需要对这项技术进行不断优化，把风险和毒副作用降到最低，才能最终用于医治病人。长远来讲，或许有这个可能，现在离技术成熟可以大规模用于治疗疾病还有相当距离，当然前景是光明的。这都是一些个人理解。

李世斌：这个问题非常好！我个人觉得这项研究所阐明的机制应该同样适用于衰老过程中罹患阿尔茨海默症（AD）的病人。我们已经知道了衰老可以导致促觉醒神经元的丢失，特别是我们今天探讨的“主角”Hcrt神经元，当然也包括其他神经元如蓝斑核去甲肾上腺素能神经元的丢失。医院的研究人员发现AD病人在接受治疗时的脑电图监测显示了更加明显的睡眠问题。研究人员在对比AD病人和不曾罹患神经性退行性疾病的病人大脑样本时，发现了AD病人大脑样本中促觉醒作用的神经元的丢失更加明显。

特别值得一提的是，患有AD的病人，他们的Hcrt神经元的丢失相比较于他们同龄的没有患AD的人的神经元尤为明显，多达三分之一左右。也就是说，基于在健康衰老过程中神经元丢失的基础上，AD发病又加剧这一情况，又有约三分之一的Hcrt神经元丢失了。

β淀粉样蛋白被认为是AD产生的关键促进因素，也是一种检测AD的指标。研究人员开发了很多AD小鼠模型，其中包括β淀粉样蛋白模型。体外的电生理记录发现β淀粉样蛋白小鼠模型的神经元，特别在海马神经元里，神经元的放电频率会加快，也就是神经元的兴奋性提高了。

AD的发生，为什么会导致更多神经元丢失？我个人的理解是因为大脑中有β淀粉样蛋白的累积，神经元对β淀粉样蛋白比较敏感，那么就会更多地放电，也就是兴奋性升高了。也有研究显示，β淀粉样蛋白可以影响神经元兴奋性递质的再摄取，从另一个角度上调了兴奋性功能。

有一种毒性叫做兴奋性毒性(excitotoxicity)，如果长期神经元不停地放电，其实最终的结局，通俗点来说的话，神经元肯定会死掉。这其实是一个负向反馈过程，在AD的发展过程中，它会促进神经元兴奋性的提高，兴奋性提高之后，患者的睡眠质量就得不到保证，睡眠质量下降可能进一步地促进β淀粉样蛋白的堆积，形成一个负向的反馈。所以我认为年老模型里的研究成果很可能适用于诸如AD这类神经退行性疾病之中。

李世斌：尽管在某些特定情况下，年轻群体中也有可能出现睡眠碎片化现象，特别是作为其他疾病的并发症，我的理解是其发生机制应该不同于伴随衰老的睡眠碎片化，起码不会完全一致，因为大脑从年轻到年老是一个系统性的变化过程，年轻的大脑还没有经历这一过程。因为我们还没有这方面的数据, 我可以分享一些个人的猜想。

比如说，临床上有一种睡眠疾病叫做睡眠呼吸暂停综合症（sleep apnea），其中有一种是阻塞型睡眠呼吸暂停，常见的表现就是打呼, 并伴有短暂呼吸停顿。由呼吸暂停引起的这种短暂的睡眠碎片化是一种在年轻的群体中常见的现象，所以与年老群体发生睡眠碎片化的原因可能不完全一样。。

呼吸暂停的时候，大脑会立刻检测到这个信号，然后快速地做出调整。比如，喉咙里的肌肉由于松弛，把气道暂时性地阻塞了，导致其呼吸不畅，大脑的反馈机制监测到了身体里面的氧含量异常或者其他指标异常，然后发出特定信号，提高喉咙里肌肉的张力，重新让气道保持顺畅，让身体的内稳态恢复到正常的状态。

在睡眠过程中，很多人并没有感觉到自己的呼吸短暂地暂停了，但是实际上大脑已经做了很多工作。这个过程中，如果监测他们的脑电图或者肌电图的话，可能他们已经符合觉醒的标准了，但是这背后的机制和衰老过程中的睡眠碎片化的机制是不一样的。

临床还有另外一种常见的情况称为不宁腿综合征 (restless legs syndrome) 的疾病，患者强烈渴望活动双腿，并且腿部伴有使人不愉快或不舒服的感觉。症状发生在患者活动量减少时，通常晚间，因此也有睡眠碎片化的特征，但病因还不明确。

李世斌：其实刚才我们已经聊到一些了，我们刚才说到的神经退行性疾病，这是我非常感兴趣的研究方向之一。我们机体会健康地衰老，也会有伴随神经退行性疾病的衰老，比如AD以及帕金森疾病，后者实际上和多巴胺能神经元的退化是相关的。我自己比较感兴趣的方向是想把基础研究和临床上一些未解的疾病联系起来，知其然，更要知其所以然，厘清发病机制，方能对症下药。我觉得对基础研究的深入理解，是开发有针对性的临床治疗方案的基础，所以在我想以后这方面我会做更多的工作。

李世斌：我在读博士的时候，研究的是突触可塑性。那时候选择研究这个主题是因为我对大脑是如何形成学习记忆的非常感兴趣。另外一个比较感兴趣的领域是意识的产生，可能听起来比较抽象。具体来说，我对意识形成的神经基础非常感兴趣。

李世斌：谢谢你们的关注。其实，无论研究什么，它都需要有连续性，特别是实验技术方面。使用最合适的研究技术来回答一些特定的科学问题，所以我觉得，在未来5-10年间，如果我自己建立了实验室，我还是会沿着睡眠研究这个方向来开展工作。

刚才我们聊过，在伴有神经退行性疾病的衰老过程中，睡眠状况是如何变得更为糟糕，而睡眠质量下降的同时，机体的免疫力也会下降。这其实是一个系统的变化过程，我想在这些方面做一些更加深入的研究，想探索伴有神经退行性病变的衰老过程，睡眠问题产生与神经退行性疾病发病的相互关系。

然后，我对另外一个睡眠研究的分支比较感兴趣：压力是如何影响睡眠的。两年之前，我还发表过另外一篇文章，主要是探究了下丘脑的一个神经环路，这个神经激活时可以引发一种超兴奋状态以及免疫抑制，模拟压力所导致的失眠。

身体是一个非常复杂的整体，包括多个功能系统。而大脑则是这一整体的“司令部”。通过调控某一个神经环路或者一个神经核团，可能会在行为层面的引起一些改变。但是这并不能说明大脑中只有这一个神经核团在调控这些功能，可能有多个神经环路，参与了功能的调控。这些神经环路还有可能与其他系统对话，比如免疫系统。所以，我可能会在这个方向开展进一步研究。

李世斌：这个问题非常好，也问到了我们的心坎上。我觉得还是要给青年科学家多一点时间，多一点耐心。当我们想弄清楚一个科学问题，比如一个疾病的发病机制，我们需要做大量基础研究，这本身可能就需要很多的时间，而且我们的研究肯定也不是一帆风顺的，要开展一系列实验来验证不同的假说。 

所以我们需要多一些包容，多一些耐心。一项高质量的研究，通常不是一蹴而就的，而是需要一定时间的积累。

我认为你们TCCI这个追问科普平台非常好，可以让我们青年科学家的声音很好、很快地传播到我们科研圈之外的大众，让他们也可以了解到我们在做什么。我觉得当我们作为科学工作者和其他领域的工作者有一些交流之后，我们相互之间会有更多的理解。在这方面，你们平台已经做得很好，有更多的理解与交流之后，会促进知行合一的过程。基础研究、临床实践以及大众之间加强交流，我们才能共同努力把问题解决好。

封面图：Bryan Coleman