重要数据|中国团队《新英格兰医学杂志》发布新型冠状病毒研究

概述

2019年12月，中国武汉出现了一群与海鲜批发市场有关的不明原因导致的肺炎患者。通过对肺炎患者的样本进行全基因组测序发现了一种从未见过的乙型冠状病毒属（betacoronavirus）病毒。该病毒从感染者气道上皮细胞中分离出，随后将其命名为2019-nCoV，这种病毒归属于Sarbe病毒亚属，正冠状病毒亚科，但形成了另外一簇的进化分枝。2019-nCoV与MERS-CoV和SARS-CoV都不同，它成为可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。对该病毒的加强监控和进一步的研究正在进行中（由中国国家重点研发项目和国家传染病防治重大专项资助）。

介绍

新发和再发传染病是全球公共卫生面临的挑战。冠状病毒是一种具有包膜的RNA病毒，广泛存在于人类、哺乳动物和鸟类宿主，可以导致呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。已知有6个冠状病毒属对人类致病，其中以229E、OC43、NL63和HKU1为主，可以导致免疫功能正常宿主发生普通感冒症状；另外两种病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征病毒（MERS-CoV）是人畜共患传染病，有时与致命疾病有关。SARS-CoV是中国广东2002年至2003年间暴发的严重急性呼吸综合征的病原，而MERS-CoV是2012年中东地区暴发的严重呼吸道疾病的病原。基于冠状病毒的高流行率和广泛分布，其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组，以及人-动物间接触活动的增加，加之频繁的跨物种感染和偶尔的动物传人事件，新的冠状病毒可能会周期性地出现在人类面前。

2019年12月末，几家当地卫生机构报告了一组不明原因的肺炎患者，这些患者在流行病学上与武汉的一家海鲜和湿畜批发市场有关。12月31日，中国疾病预防控制中心（中国CDC）派出快速应急小组会同湖北省和武汉市卫生机构进行了流行病学和病原学调查。在暴发的早期，我们报告了这项调查的结果，确定了肺炎集群的来源，并描述了在肺炎患者中检测到的一种新型冠状病毒。我们还描述了其中两名患者肺炎的临床特征。

结果

患者情况

2019年12月27日，出现严重肺炎症状的3名成年患者被收入武汉一家医院。 患者1为49岁女性；患者2为61岁男性；患者3为32岁男性。收集了患者1和患者2的病史： 患者1没有潜在的慢性基础病史，但从2019年12月23日出现发热（体温37-38°C）、咳嗽及胸部不适症状。

在临床症状出现后4天，咳嗽和肺部不适症状加重，但发热症状缓解，基于CT扫描的结果做了肺炎诊断。此患者的职业为海鲜市场的零售商贩。患者2初始症状从2019年12月20日开始，出现了发热和咳嗽。在起病后7天出现呼吸困难且后续2天进行性加重（胸片资料见图1），在此期间进行了机械通气。该患者曾经常出入海鲜市场采购。患者1和患者3在经过治疗后于2020年1月16日出院，但患者2在2020年1月9日死亡，没有采集到患者的组织标本。 

图1. 胸片

新型冠状病毒的检测和分离

2019年12月30日，从武汉金银潭医院采集了这3位患者的肺泡灌洗液。 用RespiFinderSmart22试剂盒对这些临床标本进行了常规检测，但未发现特异性病原体（包括HCoV-229E， HCov-NL63, HCoV-OC43, and HCoV-HKU1）。对这些患者的肺泡灌洗液进行了RNA提取，作为克隆载体模板；采用Illumina 和Nanopore测序相结合方法进行了基因测序。从单个标本中获得了超过20,000个病毒序列读长，大多数序列结果显示与乙群冠状病毒属的B谱系匹配，有超过85%基因序列与此前报到的蝙蝠体内分离到SARS-样冠状病毒 (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。我们对一段RdRp区域的泛乙群冠状病毒的RNA进行了实时逆转录PCR检测，也得到了阳性的结果 （尽管检测到样本循环数阈值高于34）。临床病毒分离采用人呼吸道上皮细胞和Vero E6 、Huh-7细胞系，分离出的病毒被命名为2019新型冠状病毒。 

为了明确2019-nCoV感染的人呼吸道上皮细胞内可否观察到病毒颗粒，模拟感染和2019新型冠状病毒感染的人类呼吸道上皮细胞培养物每天用光学显微镜进行观察，培养6天后用透射电镜观察。在人呼吸道上皮细胞表面接种96小时可以观察到细胞病变。通过显微镜观察，可以看到在视野中央（见图2），细胞缺乏纤毛运动。 但在Vero E6和Huh-7细胞系培养6天后无特异性细胞病变。

图2. 人气道上皮细胞接种2019-nCoV后的细胞培养图片

负染法电镜下观察2019新型冠状病毒一般呈球形，但有些呈多形性（见图3）。直径在60-140nm之间。病毒颗粒有明显的棘突，大约9-12nm, 导致病毒呈现了日冕状。在人气道上皮超薄切片中发现了胞外游离病毒颗粒和胞质膜囊内充满病毒颗粒的包涵体。观察到的这一形态与冠状病毒科一致。

图3. 2019-nCoV在透射电子显微镜下图片

为了进一步确定病毒特征，对患者临床标本（肺泡灌洗液）和人类呼吸道上皮细胞分离到的病毒用Illumina和Nanopore 进行了测序分析。从这3位患者体内都分离到了新型冠状病毒。从肺泡灌洗液中获得了2个全长的冠状病毒序列（BetaCoV/Wuhan/IVDC- HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121），和一位患者体内分离到的病毒全长基因序列(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119)。这3个新型冠状病毒全基因组序列已经上报给GASAID组织。(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, accession ID: EPI_ISL_402119; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, accession ID: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019, accession ID: EPI_ISL_402121)且86.9%核酸序列与之前报道过的蝙蝠体内分离到的SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。这3个新型冠状病毒基因汇总形成了Sarbe冠状病毒亚属中的独立分枝，显示了典型的乙型冠状病毒属结构：一个5′非翻译区（UTR）、复制酶复合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因、3′UTR和几个未识别的非结构开放读码框。

尽管2019-nCov与蝙蝠体内分离到的乙型冠状病毒相似（图4），但是与SARS冠状病毒和MERS冠状病毒有明显不同。这3份来自武汉的2019 新型冠状病毒与2份来自蝙蝠体内的SARS样病毒株ZC45，ZXC21 形成了Sarbe 冠状病毒亚属B谱系中一个新的分枝；来自人体的SARS冠状病毒则与中国西南部蝙蝠体内分离到SARS样冠状病毒共同形成了Sarbe冠状病毒亚属的另外一个分枝。

2019-nCoV和-冠状病毒在保守区域复制酶（ORF 1ab）序列一致性方面没有达到90%，因此2019年武汉病毒性肺炎的可能病原体2019-nCov是一种新型乙型冠状病毒，属于冠状病毒科中的Sarbe冠状病毒亚属。 

图4. 2019-nCoV和正冠状病毒亚科中其他乙型冠状病毒基因系统发育树分析图

讨论

我们报道了2019年12月和2020年1月在中国武汉住院患者中发现的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）。该病毒存在的证据包括在三名患者的支气管肺泡灌洗液中用全基因组测序、直接PCR和培养方法均鉴定出此病毒。这种可能由冠状病毒引起的疾病被命名为“新型冠状病毒感染肺炎”（NCIP），完整的基因组已提交给GASAID网站。系统发育树分析显示，2019-nCoV属于乙型冠状病毒属；乙型冠状病毒属包括了在人、蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒（SARS冠状病毒、蝙蝠类SARS冠状病毒等）。我们报道了此病毒的分离及特异性细胞病变作用和形态学的初步描述。

多年来，分子技术已被成功运用于鉴定感染源，全基因组高通量测序是发现病原体的有力工具。二代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病暴发的方式，提高了我们对疾病发生和传播的理解、加速病原体的鉴别和促进数据的共享。我们在这篇报道中描述了利用分子技术和全基因组测序发现的一种新型冠状病毒，它可能是导致中国武汉3例重症肺炎的元凶。

虽然建立人气道上皮细胞培养方法是费时费力的工作，但它是分析人呼吸道病原体的重要研究工具。我们的研究表明，先在人气道上皮细胞培养物上增殖呼吸道分泌物，再用透射电镜和全基因测序分析培养上清物，成功地观察和检测到了新的人冠状病毒，这可能是传统方法无法做到的。

我们还需要进一步建立可准确、快速鉴别呼吸道未知病原体的方法。基于在此研究中得到的3条完整基因组，我们设计了几个针对2019-nCoV基因组的ORF1ab、N和E区域的特异和敏感的检测，可以检测出临床样本中的病毒RNA。引物集和标准操作程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019-nCoV感染。最新的数据显示，中国已有830人检测出2019-nCoV。

虽然我们的研究没有完全遵循科赫法则，但我们的分析提供了武汉暴发2019-nCoV的证据。我们还需提供有关2019-nCoV引起武汉疫情的其他证据，包括在患者的肺组织中用免疫组化方法检测到2019-nCoV抗原，从同一患者两个时间点的血清标本中检测出可证实血清转化的抗病毒IgM和IgG抗体，以及来自动物（猴子）实验的致病性证据。至关重要的是进行流行病学调查，以确定感染的传播方式、繁殖间隔期和感染的临床症状谱，从而为制定预防、控制和制止2019-nCoV传播的战略提供指导。