一文读懂：循环肿瘤细胞（CTC）检测的临床应用及其面临的挑战和对策

依托上文所介绍的富集鉴定策略，目前已经形成了几十种各不相同的商业化CTC检测体系。然而遗憾的是，这些方法都存在某种程度的不足，并没有在临床实践中得到大规模的推广应用。为了更好地满足临床需求，未来的CTC检测技术必须面临如下挑战并找到合适的应对之策。

1. 更高的富集效率

只有尽可能多的捕获CTC的完整群体，后续所获得的信息才会更加全面和可信。然而，有相当比例的晚期患者检测不到CTC或者CTC的数量不足以完成下游的分析，这说明检测方法的富集效率还有待提高。也有研究者在尝试省略富集的步骤，这必须借助更为敏感的数字RT-PCR技术或者高分辨率的图像扫描技术，目前的应用并不广泛。

影响富集效率的原因可能有多个，相应的解决策略也有所不同。首先，作为最常用的富集手段，依赖单一抗体EpCAM的阳性分选是导致富集效率不高的重要原因之一。这是因为肿瘤在转移过程中会发生上皮间质转化现象，由上皮细胞特征转换为间质细胞特征，这部分细胞会因为EpCAM的表达降低或者缺失而被漏检。针对该问题，一些技术尝试采用多个抗体的组合或者采用CD45阴性分选来解决；也有一些新技术选择了不依赖抗原表达的非亲和性方法。然而，CTC群体的异质性可能远超我们的想象，而每一种富集方法也并非完美无缺，因此近年来的一种新趋势是采用多种富集手段的联合，实现彼此之间的优势互补，进一步提高富集效率，但是过长的处理步骤也可能会影响CTC的活性。未来也许可能还有新的CTC富集策略，但是这要建立在对CTC生物学特性有进一步认识的基础之上。其次，粗放式的操作可能是导致富集效率不高的另外一个原因。如在经典的CellSearch系统中，富集和荧光标记步骤都是在15 mL的离心管中进行，期间还会反复冲洗，这难免会造成不必要的细胞损失。精细化的微流控芯片是解决这一问题的可行方案，这些芯片一般只有普通载玻片大小，一次可以处理1~2 mL血样，发生损耗的概率相对更小，而且可以极大节省试剂支出和成本。

然而，检测血量过低也会影响检测的效果，一方面是因为其中的CTC数目相对有限，另一方面是因为检测的采血量一般仅占人体正常血液量的0.1%左右，由此所带来的采样误差将会影响各个批次检测之间的可比性。通过增加采血量来提高检出率并不可行，因为不仅患者难以接受，后续的处理也会增加很多的负担，难以提高检测通量。在这种情况之下，体内检测可能是一种潜在的解决方案，比如CellCollector技术就是将EpCAM包被的金属丝插入到患者的肘静脉血管中进行CTC收集，静置30 min处理的血量可以达到1 500 mL，远远高于体外检测的血量，检出率优于传统的CellSearch系统。此外，动物实验的结果提示，持续的体外循环富集所获得的CTC数量要明显高于单次采样的结果，但是这种操作在人体中的安全性和可靠性还有待进一步的验证。

2. 特异的鉴定策略

外周血中白细胞的数量众多，即使经过CTC富集之后仍然会有大量残留，因此必须通过特异的方法对CTC进行鉴定。在现有的方法之中，表型鉴定是一种即时检测，但是难免会出现假阳性和假阴性的结果；功能鉴定的特异性更好，但是耗时较长，不适合在临床常规开展。

近期，有研究者提出通过葡萄糖摄取实验来进行CTC的鉴定，其原理跟PET-CT类似，通过代谢能力的差异来判断目的细胞的良恶性，该方法既能够像常规表型鉴定一样进行即时检测，又能够反映目的细胞的功能特点，如果能够得到更多临床数据的验证，未来将具有良好的应用前景。这个方法也提示我们，制定特异的鉴定策略需要充分了解CTC的生物学特性，这也是CTC基础研究领域的重要职责之一。

3. 自动化和标准化

自动化和标准化主要包括样品处理和图像扫描分析两个方面。其中，样品处理涉及自动化设备的研发、操作流程和技术参数（包括离心转速、孵育时间、加样量等）的锁定、试剂和耗材（包括体积、浓度、抗体克隆号、材质、生产厂家等）的统一、全程质控和故障排查方案等，这些环节是避免人为影响因素的干扰，保证检测结果可比性的必要手段。目前，不少新技术已经在做这方面的努力并且获得了不错的效果。然而，自动化的图像扫描分析系统依然是很多检测方法的软肋，只是依靠人工进行操作和分析不仅费时费力，而且容易漏检。一个可靠的图像扫描分析系统不仅需要更高性能的显微镜来提高图像的质量，还需要反复优化并锁定荧光标记抗体的浓度以及对应的曝光时间，需要研发配套的软件和算法进行显微镜的自动调焦、目的细胞的坐标定位以及智能识别和判读等。这方面的工作是CTC检测技术未来开发的难点，必须依赖生物学、光学、机械力学以及软件开发和人工智能等领域的深度交叉融合才能有望实现突破。

4. 单细胞的捕获

我们现在越来越清楚地认识到，CTC是一个异质性的群体，其中具有干细胞表型或者转移增殖潜能的只是一小部分细胞，如果只做整个群体的笼统分析，这些细胞的信息将会被错失掉，为避免这种情况，需要采用能够了解每一个细胞特征的单细胞分析技术。目前在肿瘤组织中所采用的单细胞测序技术（如10X genomics）通过“条码（barcode）”为每一个细胞设定一个唯一的标签，可以实现高达数千个细胞的高通量检测。然而，由于CTC的数量相对稀少，上述技术并不适合，一方面是因为按照单个细胞折算下来价格昂贵，另一方面是细胞群体太少将会影响其区分。

关于CTC的单细胞分析，首先需要实现单个细胞的捕获和回收，目前采用的方法包括显微镜下的手动吸取、载玻片上的显微切割、通过“陷阱”或“微钩”之类的方式为目的细胞确定坐标定位然后进行自动捕获，以及将细胞形成液流或单细胞微滴之后通过荧光信号或电荷信号进行分选等。而拿到单个细胞之后，还需要进行全基因组扩增（whole-genome amplification），目前常用的方法包括多重置换扩增（multiple displacement amplification）和基于多重退火和环化的扩增循环（multiple annealing and looping-based amplification cycles）。

总的来说，CTC单细胞分析的技术门槛较高，一般需要结合高性能的显微镜进行细胞的确认，耗时耗力，也很难提升检测通量，目前更多还是用于基础研究领域。

5. CTC的体外培养

CTC的体外培养是对其进行功能分析，研究肿瘤转移和耐药机制的必要手段，而相关的研究结果反过来又可以推动CTC检测技术的改进和提高。但是体外培养并不是一件容易的事情，即使是人类原发肿瘤也只有在极少数情况下才能够建立起可以连续传代的细胞系。

对于CTC来说，这会更具有挑战性，因为CTC体外培养的建立必须同时满足两个前提条件，二者缺一不可。首先是要有合适的技术能够富集到足够数量的活CTC，之前文献报道成功建立体外培养的CTC数值是1 109个和509个/7.5 mL外周血，现有的很多CTC检测技术都无法实现这一点。其次，需要创造一个合适的培养条件，能够在体外有效的刺激和支持CTC的生长，但是目前为止，我们对于这些培养条件的具体细节还缺乏必要的了解。对于第一个条件来说，目前最为矛盾的一点就是，用于捕获CTC的最好的方法要么需要做细胞固定，要么需要使细胞承受较高的剪切力，这些都会导致细胞活性的减少；相反，能够最好地保留细胞活性的方法在富集CTC时的效率和效果并不好。如何平衡细胞活性和CTC的有效捕获是CTC的检测技术不得不面对的棘手挑战。对于第二个条件来说，一般需要添加一些刺激上皮细胞生长的因子，可以采用贴壁培养、无血清悬浮培养以及添加滋养层细胞进行共培养等方式。尽管这些方法被证实是可行的，但是总体来说成功率并不高，而且在很大程度上要依赖所富集的CTC的数量和活性，比如进展期的患者就更容易成功。近期，有研究报道可以采用类器官的培养方式来进行CTC的培养，通过添加特殊的细胞外基质材料，在添加了生长因子的常规培养条件下即可以维持细胞长时间的存活，这可能是未来CTC培养的一个发展方向。

6. 循证医学证据和监管审批

CTC检测在临床没有得到广泛应用的关键原因之一是缺乏循证医学的证据，难以通过监管部门的准入审批。目前唯一通过美国和我国监管部门审批的只有CellSearch系统，这不仅是因为该系统的操作规范标准，结果的可比性很好，更重要的是由此保障了多中心临床研究的开展。这些研究设计严谨，随访数据规范翔实，证据级别很高，对临床实践具有重要的指导价值。然而，很多新型的CTC检测技术在临床研究方面是非常欠缺的，仅仅完成某些患者的测试只能证实相关技术的基本性能，距离真正的临床应用还相去甚远。

此外，关于采用CTC的实时伴随诊断，目前还缺乏公认的判读标准，未来也需要结合大样本的临床研究来加以确立并不断地对其进行修正。这些多中心的临床研究是一个非常艰难和漫长的过程，对于任何CTC技术的研发企业来说都是一项巨大的负担，但是对于整个行业的发展来说也是一个不得不面对的挑战，因为只有这样才能积累足够可靠的循证医学证据，最终获得临床的准入。

总结及展望