1 引言
传统光学显微镜的最大空间分辨率限于光波长的一半. 该衍射极限是由于光束在遇到物体时发生轻微弯曲而产生的衍射屏障. 根据Abbe（1873）的研究，波长为λ的光束由数值孔径为nsin α（sin α<1）的透镜聚焦后，难以分辨比距离d=λ/(2nsin α)更近的物体（Gu, 1996, 2000）. 光衍射使得极小物点通过光学显微镜后模糊成有限尺寸像点.显微镜分辨率由点扩散函数（PSF）的尺寸来决定，其中PSF被定义为点物在像空间的三维（3D）强度分布图. 另一种在频域中确定显微镜分辨率方法是测量光学传递函数（OTF）的截止频率. 这里，OTF是PSF的傅立叶变换形式（Gu, 2000）. 在可见光波段，传统光学显微镜横向分辨率为200–300 nm，轴向分辨率为500–700 nm.2014年，诺贝尔化学奖共同颁发给Eric BETZIG、Stefan W. HELL和William E. MOERNER，以表彰他们为克服由光衍射造成成像分辨率极限而开发的超分辨率荧光显微镜. Stefan W. HELL是第一个同时在理论（Hell and Wichmann, 1994）和实验上（Klar and Hell, 1999）利用受激发射损耗原理（STED）突破衍射极限的科学家. Eric BETZIG（Betzig, 1995; Betzig et al., 2006）于2006年在光激活定位显微镜（PALM）方面做出开创性工作. WilliamE. MOERNER则第一次对凝聚相中单分子进行光学检测和光谱学分析（Moerner and Kador, 1989），并在室温下观察绿色荧光蛋白（GFP）突变体的开/关闪烁和转换行为（Dickson et al., 1997）.近年来，一些新的超分辨荧光和非荧光方法得到发展. 其中基于荧光方法可进一步被分为空间域和时间域两种. 本文综述荧光和非荧光光学显微镜的基本原理、研究成果和发展，及其在其他领域的应用.
2.1 基于荧光的超分辨显微技术
结构光照明显微镜（SIM）利用带有空间结构照明的宽视场显微镜而实现超衍射极限空间分辨率. 如图1a所示，光栅用于产生横向（Gustafsson, 2000）或三维（Gustafsson et al., 2008）变化的结构化照明图案. 通过将高频信息以莫尔条纹形式移动到观察图像中，结构化照明可将分辨率扩展到截止频率之外，其中莫尔条纹通过空间频率混合产生（图1c）. 然后通过计算提取新图像. 该方法的空间分辨率被证实是传统显微镜的两倍. 把SIM应用于三维空间中，可使轴向和横向分辨率加倍. 目前已获得横向约100 nm和轴向约300 nm的分辨率显微成像（Schermelleh et al., 2008; Shao et al., 2011）.![]()
图1 结构照明光显微镜（SIM）和饱和结构光照明显微镜（SSIM）的原理：（a）由光栅产生的结构照明；（b）SIM激励模式（蓝线）和SSIM激励模式（红线）;（c）用SIM和SSIM对样品成像
在饱和结构光照明显微镜（SSIM）中，利用荧光发射的饱和非线性现象，理论上可实现无限分辨率（Gustafsson, 2005）. 该饱和现象发生于荧光团受到约106 W/cm2光强照射时.在高光强度的激发光照射下，处于基态的荧光团立即被泵浦送到激发态. 荧光寿命由荧光发射率确定. 当荧光团达到饱和时，其荧光与激发光强度不成正比. 在该情况下，得到饱和激发结构照明图案. 当强度达到饱和水平时，图案变得平坦（图1b）. 图1c显示通过混合具有更多傅立叶分量的饱和激发结构化照明图案，可以编码更高频率的信息.分辨能力由信噪比决定，而信噪比又受限于光漂白特性. 实验结果表明，使用明亮光稳定样品（Gustafsson, 2005）和光转换蛋白（Rego et al., 2012; Li et al., 2015）可以获得小于50 nm二维点分辨率.图像扫描显微镜（ISM）已由Sheppard（1988）描述并由Müller和Enderlein（2010）证实. 它使扫描共焦图像的分辨率加倍. 其原理是从激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）中提取固有高频信息. 超分辨率信息的本质可由两种不同方式理解：第1种是基于LSCM中将激发和发射PSF重叠方法（Sheppard, 1988; Sheppard et al., 2013）；第2种是与SIM相同的描述（Müller and Enderlein, 2010）. 虽然仅通过减小LSCM中针孔尺寸就可以收集超分辨率信息，但是较小的针孔会抑制大量光线，从而降低信噪比. ISM可以恢复丢失的超分辨率信息. 它的光路包括：用阵列检测器记录穿过针孔的信号并在每个扫描位置获得图像. 恢复超分辨率图像的最简单方法是将像素重新分配（Sheppard et al., 2013）. 对于每个扫描位置，所获得的图像其像素在一定程度上衰减，并且该图像被添加到以光束扫描位置为中心的动态总图像中. 待重建完整个图像后，通过傅立叶重新加权可以进一步提高分辨率. 为加快采集，在ISM中应用数字微镜（DMD）可以获得多焦点结构照明（York et al., 2012）. 根据这一想法，在共焦旋转盘显微镜中也可以获得ISM（Schulz et al., 2013），但这些方法仍需要记录和存储大量数据，以重建超分辨率图像并降低采集速度. 该问题可由基于重新扫描的全光学ISM解决（de Luca et al., 2013; Roth et al., 2013; York et al., 2013; Azuma and Kei, 2015）. 基于重新扫描的全光学ISM也适用于双光子激发荧光和二次谐波成像（Gregor et al., 2017）.STED显微镜的概念首先由Hell和Wichmann（1994）提出，并且由Klar和Hell（1999）进行实验证明. 通过受激发射选择性地让荧光团失活以实现超分辨率. 在损耗光束下，处于激发态的荧光团与光子相互作用，该光子与激发态和基态之间的能量差相匹配（图2a）. 在这种情况下，荧光团的荧光发射被耗尽.STED的光路基于共聚焦显微镜而成. 激发光束和STED光束用于扫描样品（图2b），其中STED光束由连续波（CW）或脉冲激光源产生. 将相位板放在STED光路中以产生环形光束，其中心处具有零光场分布，而周边具有非零光场分布. 因此，被有效激发的PSF变得更尖锐（图2c）.![]()
图2 受激发射损耗（STED）显微镜的原理：（a）荧光发射和受激发射过程的Jablonski图；（b）STED显微镜的示意图；（c）生成有效点扩散函数（PSF）在脉冲模式STED中，激发光束和STED光束之间的相对时间延迟对于优化受激发射过程是至关重要的. 当电子处于激发态时，STED光束到达样品. 此外，STED激光束的脉冲宽度被调到一个介于染料振动态和激发态寿命之间的值，例如200–300 ps.在CW STED（Willig et al., 2007）中，速率为kexc的CW激发光以概率N=kexc/(kexc+kfl)填充激发态；荧光衰减速率kfl=1/τfl由激发态寿命的倒数给出. CWSTED光束的添加会产生另一个衰减率kSTED=σI，从而得到概率N=kexc/(kexc+kfl+kSTED)，其中σ是受激发射的分子横截面，I是STED光束强度单位面积下每秒的光子数. 当kSTED>kexc>kfl时，STED占主导地位，这意味着I>1/(στfl). CW光束的功率是脉冲光束平均功率的3.6倍. 然而，相比于STED脉冲光束所需的同步单元，CW STED极大简化了STED超分辨率显微镜的制作.损耗光的波长应该在染料发射波长范围内.因此，在位于染料发射光谱的拖尾处选择STED光束的波长，以避免波长被再吸收. STED光束和发射光谱的横截面越大，受激吸收截面就越大，从而获得更高分辨率（Farahani et al., 2010）.决定STED显微镜分辨率的有两个因素：STED激光束强度和荧光团饱和强度. 后者是关于STED激光束波长、脉冲宽度和荧光团固有特征（例如基态和激发态的寿命和粒子数动力学）的函数. 由Westphal和Hell（2005）定义的光学分辨率极限的扩展版本中对此进行了数学描述：![]()
(1)
其中λ是激发光波长，nsin α决定物镜的数值孔径，n为介质折射率，α为焦距角的一半，I为STED光束强度，Is为荧光团饱和强度.通常，STED可以达到20–60 nm横向分辨率（Westphal and Hell, 2005; Göttfert et al., 2013; Butkevich et al., 2016）. STED也可和4Pi显微镜（STED-4Pi）相结合，轴向分辨率为30–40 nm（Dyba and Hell, 2002）.4. 基态损耗显微镜
基态耗尽（GSD）显微镜由Hell和Kroug（1995）提出，并由Bretschneider 等人（2007）在实验中证实. GSD的光路是基于共聚焦扫描显微镜；通常，荧光可以从基态自由激发并以自发辐射方式返回基态. 然而，如果施加具有适当波长的激光束，则染料被激发至长寿命的暗态（例如，三重态）. 因此，长寿命暗态的分子不能从基态被激发（Bretschneider et al., 2007）（图3）.图3 基态损耗（GSD）显微镜下荧光发射过程和长寿命暗态的Jablonski图超分辨率成像是通过施加激光束以消耗环形区域内荧光团的基态来实现的. GSD光路可以用两个不同模式实现. 一个在STED设置中需要两个光束用于耗尽和激发. 另一个只需要一个环形光束. 在除了环形圈最小值之外的聚焦区域内，荧光在激发态下饱和，并且扫描后获得具有超衍射极限分辨率的一个“负”像. 将“负”像去卷积之后获得最终图像（Rittweger et al., 2009b）.STED具有高Is值（约107 W/cm2），因此需要强烈的耗尽激光束（通常>109 W/cm2）. 与STED不同，GSD需要低Is（约7 kW/cm2）. 它的分辨率为80 nm，耗尽激光束强度为80 kW/cm2（Bretschneider et al., 2007）.可逆饱和光学线性荧光跃迁（RESOLFT）显微镜（Hell, 2007）通过耗尽方式来抑制不需要的荧光发射，从而实现超分辨率. RESOLFT的光路是基于共焦扫描或宽视场显微镜. 值得注意的是，宽场显微镜中并行的RESOLFT使用正交和非相干交叉驻波来产生大量用于并行的空心光斑（Chmyrov et al., 2013）.把RESOLFT应用于荧光探针，可以在荧光开启和关闭状态之间进行可逆地光转换. 开启状态是激发状态. 关闭状态可以是荧光团基态（Klar and Hell, 1999），或其三重态（Bretschneider et al., 2007），或可逆光可切换荧光团暗态（Hofmann et al., 2005）（图4）.![]()
图4 可逆光饱和光学线性荧光跃迁（RESOLFT）显微镜中关于可逆光可切换荧光团的荧光发射和长寿命暗态过程的Jablonski图利用损耗光迫使周边荧光团进入暗态从而提高空间分辨率. Imax表示强度接近零，实际分辨率可近似为：
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(2)这与Abbe 衍射极限表达式不同，因为Imax/Is→∞意味着无限分辨率.RESOLFT要求具有较低Is的光学转换. 因此，实现超分辨率成像的耗尽光束的强度较低（Hell, 2007）. 例如，已证实RESOLFT采用可逆光切换荧光蛋白（FP），如FP595. 这导致其分辨率优于100 nm，对应耗尽激光束强度为600 W/cm2（Hofmann et al., 2005）. 通过4Pi显微镜组合，当在细胞内对肌动蛋白网络成像时，可获得低于40 nm的各向同性分辨率（Böhm et al., 2016）.具有低光强度（60 W/cm2）的RESOLFT纳米显微镜也被应用于光可切换有机荧光团的成像，其空间分辨率约为74 nm（Kwon et al., 2015）.单荧光分子定位超分辨率显微镜能够重建空间上孤立荧光团重心位置的超分辨图像. 在室温下对单分子进行成像使用的是电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机. 分子的位置则是通过高斯拟合定位其PSF中心来确定（图5）. 拟合精度决定定位的不确定性. 理论上，精度与检测到的光子数平方成反比，如下所述：![]()
(3)其中Vlocalization是定位精度，VPSF是PSF宽度，N是检测到的光子数. 一旦获得Vlocalization定位，就可以重建分子图像.![]()
图5 使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）定位单个分子
分辨相隔亚衍射距离的两个荧光分子可通过记录它们在不同时间的荧光发射（图6）. 基于单荧光分子定位的超分辨率方法包括：PALM、随机光学重建显微镜（STORM）、闪烁定位、闪烁和漂白的贝叶斯分析（3B分析）以及基于单个分子返回的基态损耗显微镜（GSDIM）.![]()
图6 光激活定位显微镜（PALM）、随机光学重建显微镜（STORM）、闪烁定位、闪烁和漂白的贝叶斯分析（3B分析），以及基于单个分子返回基态损耗显微镜（GSDIM）的原理
光激活定位显微技术（PALM）的首次实现是采用名为EosFP的光转换FP（Betzig et al., 2006）. 它是基于宽视场荧光显微镜搭建的. 光转换FP的发射波长可从一个波长转换为另一个波长. EosFP在516 nm波长下发出绿色荧光. 当被接近400 nm波长的光束照射时，其发射波长变为581 nm. 该变化是由光诱导引起的，即由发色团旁的肽骨架断裂引起的（Wiedenmann et al., 2004）. 对一部分EosFP进行成像后，这些EosFP被光漂白，随之另外一部分EosFP被转换和成像. 该过程可以重复104个105循环，直到EosFP被耗尽.荧光PALM（FPALM）采用类似方法. 它被首次证实使用的是光激活GFP（Hess et al., 2006）.自2002年以来，已经开发了许多光转换、光激活和光切换FP（Patterson et al., 2010）. 使用UV光可以将光激活FP从暗态激活到亮态，并且通过特定照明可以打开或关闭光切换FP.Juette等人（2008）使用双平面（BP）检测，实现了横向分辨率约为30 nm，轴向分辨率约为75 nm的三维FPALM. 他们使用分束器将荧光发射光束分成更短和更长路径以形成两个检测平面用来确定z位置（Juette et al., 2008）.
在Shtengel等人（2009）的研究中，干涉PALM（iPALM）可实现分辨率低于20 nm的三维蛋白质定位. iPALM结合同步多相位干涉测量法在单光子光活化定位显微镜的基础上搭建.
3. 随机光学重建显微镜
随机光学重建显微镜（STORM）也是基于宽视场荧光显微镜构成的. 它被首次证实是采用Cy3—Cy5染料进行超分辨成像（Rust et al., 2006）. Cy5可以在波长分别为532 nm和633 nm光照射下进行荧光和暗态之间可逆切换，其中Cy3促进了Cy5的转换（Bates et al., 2005）. 该光学开关可重复数百或数千次循环，直至染料分子被永久漂白. 通过对RecA包覆的圆形质粒DNA成像可实现20 nm的分辨率（Rust et al., 2006）.
三维STORM通过使用柱面透镜的像散获得（Huang et al., 2008a）. 圆形荧光团位置由检查其在焦平面上下方椭圆图像来确定. 用2D椭圆高斯函数拟合图像之后，可以获得x和y坐标的峰宽，从而计算z坐标位置（Huang et al., 2008b）.
已有报道称用于超分辨成像的三维空间分辨率横向约30 nm，轴向约50 nm，且其时间分辨率快至1–2 s（Jones et al., 2011）. 三维STORM已被用于标有Cy3-Alexa647开关的绿猴肾上皮细胞中微管网络的成像.
直接型STORM（dSTORM）使用传统光切换荧光染料. 它们可以在不同波长的照明光束下进行荧光和暗态之间可逆切换. 和STORM不同，dSTORM不需要使用特殊荧光分子对. 该方法能够以约20 nm的分辨率观察细胞结构，而不需要用到活化剂分子（Vogelsang et al., 2008）.
4. 基于其他荧光分子的闪烁定位
PALM和STORM通过按时间顺序依次对分子定位来实现超分辨率成像. 这些方法需要至少两个不同波长的光束.
在定位显微镜中也可以实现荧光分子的闪烁行为（Cordes et al., 2010; Burnette et al., 2011）、量子点（Lidke et al., 2005）和NV−色心（Gu et al., 2013）.
与PALM和STORM相比，闪烁定位显微镜更简单，因为它只需要一个激光束作为激发源. 单荧光探针开启状态时的闪烁荧光发射信号被常规宽视场显微镜的成像系统探测. 对荧光强度分布进行高斯拟合可用于确定分子的定位.3B分析是一种定位荧光分子的超快速方法. 3B分析对数据集中光闪烁和光漂白的荧光分子团建立模型，并计算了荧光分子的最可能分布. 它也是基于宽视场显微镜搭建的. 该方法的好处是它可以处理许多荧光分子高度重叠的图像，大大减少原始图像数量. 基于对标准荧光蛋白在4 s时间维度上收集的数据，超分辨率图像以50 nm空间分辨率被重建，尽管该分析需要数小时的计算（Cox et al., 2012）. 在集群或云计算系统上进行并行运算可以改进由于计算成本引起的限制（Hu et al., 2013）.基于单个分子回归的基态损耗显微镜（GSDIM）是基于将大多数普通荧光分子转换为其三重态T1或另一亚稳暗态，并计算剩余或自发返回基态的荧光分子的位置（Fölling et al., 2008）. 用高强度激发光可实现具有高效率长寿命三重态的过渡，从而获得足够长三重态寿命，以致于在成像缓冲中每个图像中的任何时间仅有一部分发射荧光分子留下. GSDIM图像的分辨率低于30 nm（Fölling et al., 2008）.
GSDIM基于宽场显微镜搭建，可以使用普通荧光分子，如有机染料和蛋白质（Fölling et al., 2008; Testa et al., 2010; Nahidiazar et al., 2016）. GSDIM只需要一个激光束作为激发光源，并且需要通过相机和计算机处理来记录图像.
7. 最小发射通量法
最小发射通量（MINFLUX）是一种最近研发的使用最小光学强度重建分子坐标的方法（Balzarotti et al., 2017）. MINFLUX是基于共焦扫描机制. 与其他超分辨率方法相比，该方法需要更少数量的检测光子N来显示分子的位置.
环形激发束可被用于提供分子位置的2D信息. 将空心光在约20 μm×20 μm区域内移动，并且将环形中心零点设置为5 μs 内具有<<1 nm精度.
定位至少需要三个最好被排列为等边三角形的空心光环零点的坐标. 在三角形中心添加的第四个空心光消除了位置评估的模糊性. 因此，可用四个空心光的一组定位来测算分子位置（图7）.![]()
图7 用4个位置对一个分子定位，星形代表目标荧光点. 这4点是空心光的中心位置. 来自这4个位置的荧光信号用于定位目标荧光点. 转载自Balzarotti et al.（2017），版权所有2017年，获得美国科学促进会许可由于可以快速移动和缩放视场，因此该设置使荧光纳米显微技术有能力对各个荧光点进行短距离和长距离跟踪. 与单荧光分子定位方法相比，MINFLUX检测所需的光子仅为1/22. 该方法达到约1 nm的精度，可分辨距离仅为6 nm的分子（Balzarotti et al., 2017）. MINFLUX还能够以超过100倍的时间分辨率记录分子轨迹（Sanamrad et al., 2014）.超分辨率光学波动成像（SOFI）不需要同时或连续切换分子. 它通过时间随机开关闪烁或任何其他随机强度波动而实现超分辨率. SOFI可以在各种显微镜上实现：配备电荷耦合器件（CCD）相机的宽场显微镜、旋转盘显微镜、扫描共聚焦显微镜、全内反射显微镜等. 该方法依赖于发射点的独立随机波动，而不依赖于受控或同步的光活化效应. 它只需对样本拍摄视频（图8）.![]()
图8 超分辨率光学波动成像（SOFI）原理：（a）宽视场成像；（b）在三个相邻像素中记录两个荧光探针的移动；（c）为每个像素计算的二阶相关函数；（d）每个像素的SOFI强度值
像素中的信号为不同荧光探针荧光信号的叠加. SOFI图像（n阶）每个像素值是从原始像素时间序列的n阶累积量获得的. n阶累积量根据它们的波动对信号进行滤波，使得仅保留高度相关波动.因为发射信号限于像素内的点，所以这些点对相邻像素的荧光信号贡献产生较低非线性相关值. 通过在关联计算中减去n阶累积量可获得超分辨率. 已证实使用宽场显微镜会使空间分辨率提高5倍（Dertinger et al., 2009）.由于SOFI完全基于软件，与之前的超分辨率方法相比，它具有简单、经济、高速和低曝光率等几个优点（Dertinger et al., 2012）.2.2.1 用于远场超分辨率成像的复透镜和超透镜
1. 复透镜原理
从物体发射或散射的光包括传播和倏逝分量. 具有低波矢量的传播波携带低频信息并可到达远场. 然而，具有高波矢量的倏逝波携带高频信息在正常材料环境中传播时被阻挡在近场中. 因此，远场最终的成像没有高频信息，从而导致衍射极限.使用复透镜实现超分辨率需要两个条件：能让高波矢量波传播的材料，以及将高波矢量转换为低波矢量的放大机制即允许携带高频信息的波传播到远场.各向异性等离子体超材料提供了这样一种实用选择. 因为只需要设计沿不同方向的介电常数，等离子体超材料的整体损失减少（Podolskiy et al., 2005; Yao et al., 2008）. 最简单的各向异性等离子体超材料可以通过交替金属或电介质多层沉积来构造. 当层厚度远小于工作波长时，通常使用有效介质来近似描述沿不同方向的介电常数. 与具有球形色散各向同性介质不同，多层超材料色散特性可以设计为双曲线色散的ex’>0和ez’<0或偏心椭圆色散的ez’>>ex’>0，其中ex’和ez’是沿x和z方向介电常数的实部. 各向异性超材料具有无限波矢量值或非常大波矢量截止值的特性，即支持高波矢波的传播. 多层超材料工作波长可以通过不同材料的组合在宽波段内进行调控.
放大机制是通过将平坦层弯曲成共中心的弯曲层来实现波矢量压缩（Jacob et al., 2006; Zhang and Liu, 2008）. 目前已经提出许多实用的复透镜，包括圆柱几何形状（Pendry and Ramakrishna, 2002; Jacob et al., 2006）、锥形金属线阵列（Ono et al., 2005; Ikonen et al., 2007; Shvets et al., 2007; Zhao et al., 2010），或特殊设计的材料色散（Han et al., 2008; Kildishev and Shalaev, 2008; Tsang and Psaltis, 2008; Li LJ et al., 2009）.
第一个一维光学复透镜被证实在紫外波长下具有130 nm的分辨率（Liu et al., 2007）. 它是在圆柱形石英腔上共形沉积Ag和Al2O3多层膜而形成的. 在其他实验结果中，复透镜在365 nm工作波长下实现125 nm分辨率（λ/2.92）（Xiong et al., 2009）. 尽管如此，一些仿真结果预测更高的分辨率约为λ/9（Xiong et al., 2009）.
2D复透镜在410 nm工作波长下达到205 nm分辨率（λ/2）（Rho et al., 2010）. 它是通过Ag和Ti3O5薄膜交替层沉积在用双曲色散设计的半球形几何形状后产生的.
2. 平面超透镜原理
平面超透镜是基于具有相位补偿的超材料平板，可将平面波聚焦. 具有双曲线或偏心椭圆色散的各向异性超材料支持高频信息的传播. 因此，平面超透镜与复透镜具有相同的材料要求，例如多层（Liu et al., 2007）和纳米线超材料（Yao et al., 2008）.
高波矢量波在超材料和空气之间的界面处完全反射. 因此，需要双向耦合器将超材料中的高波矢波成分转换成空气中的低波矢波成分. 此外，该耦合器需要通过相位补偿实现聚焦功能（Ma and Liu, 2010b; Ma et al., 2011）.
相位匹配条件要求平面波从空气射入聚焦于超材料内. 这可以通过几何变化来实现，例如等离子体波导耦合器（PWC）（Sun and Kim, 2004; Verslegers et al., 2009a; Ma and Liu, 2010b; Ma et al., 2011）和成形的超材料—空气界面（Parazzoli et al., 2004; Ma and Liu, 2010a），或材料折射率变化，例如梯度折射率（GRIN）超材料（Verslegers et al., 2009b; Ma et al., 2011）.
具有椭圆色散的超透镜在紫外波长下可获得59 nm（约λ/6.2）半高全宽的焦斑（Ma and Liu, 2010b）. 由于材料损失较小，已证明在更长波长下具有更高的分辨率（约λ/8.6）（Ma and Liu, 2011）. 当波长为633 nm的正常平面波入射时，在3 mm焦距处会形成70 nm（约λ/9）大的焦斑（Ma and Liu, 2010a）. 使用介电质微球也可以实现超分辨率成像（Wang et al., 2011; Darafsheh et al., 2012, 2014; Darafsheh, 2013; Li et al., 2013; Yang et al., 2014; Astratov and Darafsheh, 2017）. 球体超分辨能力源于超强的聚焦特性，即所谓的光子纳米喷射（Chen et al., 2004; Ferrand et al., 2008）. 由于接触区域较小，球体比固体浸没物镜更能靠近样品放置（Lee JY et al., 2009; Mason et al., 2010; Kim et al., 2011）. 通过微球能获得具有样品精细细节的虚拟图像，该图像可通过共聚焦显微镜收集（图9）.
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图9 使用介电质微球的超分辨率成像
将一个介电质微球放置在光栅上（线宽为d）并从前面照射光. 来自光栅的反射光可被用来检测放大的虚像（放大系数是M）. 当微球和光栅之间的距离h足够小（照射波长λ的数量级）时，携带高频信息的近场倏逝波开始在高折射率球体中传播，然后由显微镜物镜收集. 转载自Yang et al.（2016），版权所有2016，获得美国化学学会许可
起初，该技术采用二氧化硅球开发，其中n约为1.46，直径D约为2–9 μm （Wang et al., 2011）. 之后，有研究（Darafsheh et al., 2012, 2014; Darafsheh, 2013; Yang et al., 2016; Astratov and Darafsheh, 2017）证明，利用高折射率（n≈1.9–2.1）球和液体全浸没成像的分辨率可达约λ/7–λ/6.3.1 多色成像
通过对各种波长的生物结构进行成像，多色显微镜使我们能够了解不同生物结构的功能. 不同荧光标记的共定位精度受限于成像方法的分辨率. 而多色超分辨率成像有助于纳米级细胞中分子相互作用的更好理解.
使用不同激发和发射波长的荧光分子可以实现多色STED. 目前已证实带有绿色和红色荧光小球（Atto 532对应488 nm波长下激发，603 nm波长下损耗; Atto 647N在635 nm波长下激发，在750–780 nm波长下损耗）的双色STED（Donnert et al., 2007）.多色STED成像的另一种方法是使用具有超大斯托克斯位移的荧光染料分子. 用相同STED光束耗尽它们荧光的方法能够分辨具有不同激发波长的两个荧光分子. 利用分别在488 nm和532 nm激发的DY-485XL和NK51分子，可以得到线粒体外膜和三维基质的图像（Schmidt et al., 2008）.最近相同的概念已被拓展到3个（Galiani et al., 2016; Sidenstein et al., 2016）和4个（Winter et al., 2017）荧光分子. 四色STED成像如图10所示. 具有长斯托克斯位移的新荧光分子可以提高STED显微镜的多色能力（Sednev et al., 2015）.
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图10 使某特定细胞的四色受激发射损耗（STED）成像：（a）共焦图像；（b）STED图像；（c）对应（a）中白色方块的区域放大图；（d）对应（b）中白色方块的区域放大图
激发波长为612 nm；STED波长为775 nm. 通过高光谱检测设计检测荧光，在四个通道中覆盖620–750 nm的总范围（蓝色：过氧化物酶体Atto594；绿色：vimentin-Abberior-Star635P；赤红色：巨大素-KK1441；灰色：核孔-CF680R）（Winter et al.（2017），根据CC BY 4.0获得许可）此外，另一种多色STED方法，即当单个激发和STED光束用于成像时，需要严密的线性分离算法来区分两个荧光分子（Tønnesen et al., 2011; Lukinavičius et al., 2016）.多色STORM在成像微管中得到证实，其中网格蛋白包被的凹坑参与受体介导的内吞作用（Bates et al., 2005）. 微管和网格蛋白分别用Cy2-Alexa647和Cy3-Alexa647标记. 分别使用波长为457 nm和532 nm的激光束选择性地激发荧光. 将微管与圆形网格蛋白坑分开成像，其中空间分辨率约为30 nm. 在线粒体的超分辨率成像中也证明了双色STORM（Huang et al., 2008）.具有相同活化度但不同发射波长的新可转换罗丹明染料可用于荧光微球三色成像和微管双色成像（Bossi et al., 2008）.三维多色STORM（最多三色）被用于追踪海马区域的神经连接（Lakadamyali et al., 2012）. 而双色STORM被用于研究神经元中肌动蛋白、血影蛋白和相关蛋白的组织构架（图11）（Xu et al., 2013）.![]()
图11 肌动蛋白、血影、内收蛋白和钠通道的双色STORM成像：（a）肌动蛋白（绿色）和βII血影（紫红色）的双色STORM图像；（b）肌动蛋白（绿色）和内收蛋白（紫红色）的双色STORM图像；（c）βII-血影蛋白（绿色）和内收蛋白（紫红色）的双色STORM图像；（d）钠通道（绿色）和βIV-血影蛋白（紫红色）的双色STORM图像；（e）中的肌动蛋白和βII血影C末端[（A），黑色]之间，肌动蛋白和内收蛋白[（B），蓝]之间，内收蛋白和βII血影C末端[（C），红]之间，钠通道和βIV-血影蛋白N末端之间[（D），绿色]的空间相关性;（f）轴突中皮质细胞骨架的模型
βII-血影蛋白针对其C-末端区域进行免疫染色，所述C-末端区域位于血影蛋白四聚体的中心. βIV-血影蛋白针对其N-末端区域进行免疫染色，所述N-末端区域位于血影蛋白四聚体的两端. 短肌动蛋白丝（绿色），在一端由α-内收蛋白（蓝色）覆盖，形成环绕轴突周围的环状结构. 血影蛋白四聚体（紫红色）沿着轴突连接相邻的肌动蛋白/内收蛋白环，产生具有约180至190 nm的周期性的准1D晶格结构. 转载自Xu et al.（2013），版权所有2013年，获得美国科学促进会许可
双色PALM通过对含有PAmCherry1和PA-绿色荧光蛋白（PAGFP）的COS-7细胞成像得到证实（Subach et al., 2009），其中561 nm和468 nm波长的激光束分别用于激发红色（PAmCherry1）和绿色（PAGFP）染料.被罗丹明和荧光蛋白标记的PtK2细胞中微管和过氧化物酶体的成像证实了双色GSDIM（Fölling et al., 2008）. 三色GSDIM显微技术可对特定PtK2细胞中F-肌动蛋白、网格蛋白和微管蛋白进行成像，分辨率为15 nm（Testa et al., 2010）.
3.2 活细胞成像
虽然电子显微镜比传统光学显微镜具有更高的分辨率，但样品需要镀膜并且不能存活. 相比之下，超分辨率荧光显微镜仍然可以以非常高的分辨率对活细胞成像.
由于高采集速度和对荧光分子没有特殊要求，结构光照明显微SIM是活细胞成像的一种非常普遍的方法. SIM在活细胞成像时，对应一种和两种颜色成像的体扫描速度分别为4 s和8.5 s（Fiolka et al., 2012）. 以上方法由快速可编程液晶设备和灵活的2D网格图案算法实现，从而可在激发波长之间切换.
高速SIM能够以高达11帧/秒的帧速率对活细胞中微管蛋白和驱动蛋白进行动态成像（Hirvonen et al., 2009; Kner et al., 2009）. SIM能够对DNA断裂修复过程（图12）（Lesterlin et al., 2014）和贴壁细胞中细胞骨架（Burnette et al., 2014）进行成像.
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图12 仅具有DSB诱导的RecA-GFP束细胞的三维结构光照明显微成像（SIM）（a），具有DSe焦点（b），相对于DNA（c），以及相对于膜（d）. 转载自Lesterlin et al.（2014），版权所有2013年，获得SpringerNature许可
STED纳米显微技术被应用于活细胞成像可提高扫描速度并限制视野. 活海马神经元的视频（28帧/秒）成像以60–80 nm分辨率展示了单个突触囊泡的运动过程（Westphal et al., 2008）. 利用标准荧光蛋白，活细胞STED成像需要8 s的采集时间（Rankin et al., 2011）. 此外，STED能够在小鼠脑中15 μm深处的神经元中用增强黄色荧光蛋白（eYFP）进行在体成像（图13）（Berning et al., 2012）. STED还利用荧光罗丹明和荧光卡波罗宁进行活细胞成像（Butkevich et al., 2016）. 它揭示了活神经元中的细胞骨架特征（D’Este et al., 2015）.
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图13 小鼠脑中神经元的STED成像：（a）在物镜下方用气管导管麻醉的小鼠；（b）树突和轴突结构的投影体积显示；（c）脊柱形态的瞬时动态；（d）改善的分辨率为67 nm. 转载自Berning et al.（2012），版权所有2012，获得美国科学促进会许可
PALM所需的荧光蛋白已经普遍用于活细胞成像. 用PALM对活细胞中粘附蛋白进行超分辨率成像，空间分辨率低至约60 nm，帧持续时间为25 s（Shroff et al., 2008）. 光切换eYFP标记的活细菌能够实现细胞中MreB结构的超分辨率成像（Biteen et al., 2008）.
STORM以约25 nm空间分辨率和0.5s二维时间分辨率已实现活细胞成像（Jones et al., 2011）. 其中细胞直接用蛋白质标记或用快速光转换染料通过SNAP标记.自发闪烁的荧光分子能够对活细胞中的微管进行重复延时超分辨率成像1小时（Uno et al., 2014）. 闪烁是基于分子内螺环化反应.GSDIM被用于PtK2细胞活体成像，该细胞用有机染料TMR通过SNAP标记或用荧光蛋白Citrine（Testa et al., 2010）标记.SOFI方法也被用于对特定C2C12细胞中线粒体3D网络和活体Hela细胞中3D波形蛋白结构进行成像（Geissbuehler et al., 2014）.3.3 分辨率的显著提高
STED纳米显微技术的空间分辨率强烈依赖于样品的光稳定性. 带负电荷的氮空位（NV−）色心是具有出色光稳定性和无光漂白的荧光探针. 该探针可持续非常多次激发/STED循环，几乎不存在向暗单重态转变. 因此，它们非常适合STED成像. 利用NV−色心可获得STED成像的最高分辨率（低至5.8 nm）（Rittweger et al., 2009a）. STED显微技术能够以50–100 nm的分辨率对生物样品成像而不会引起严重光损伤（Westphal et al., 2008; D’Este et al., 2015; Butkevich et al., 2016）.此外，利用NV−色心的GSD纳米显微成像技术具有7.8 nm的极高分辨率（Rittweger et al., 2009b）.如上所述，PALM、STORM、GSDIM和闪烁定位方法的分辨率由检测到的光子数决定. 理论上，大约1000个光子可以达到10 nm分辨率，但实际上由于机械漂移和高斯拟合误差， 6000个光子对应大约20 nm分辨率是很常见的（Betzig et al., 2006; Rust et al., 2006）.基于SIM、STED、STORM和PALM超分辨率显微镜的开发和商业化正在迅速发展. 最新超分辨率商用显微镜的规格见表1–4.![]()
SIM显微镜由Nikon公司（Nikon，Tokyo，Japan），Zeiss公司（Zeiss，Jena，Germany）和Olympus公司（Olympus，Tokyo，Japan）（表1）生产. N-SIM系统具有更好的横向分辨率，可提供多达五个颜色通道. SpinSR10系统构架是基于旋转盘共聚焦显微镜. 因此，其采集速度比基于宽场显微构架的N-SIM和ELYRA S.1显微镜的采集速度高200倍. 此外，ELYRA S.1可与基于PALM技术的ELYRA P.1结合使用. 亦可在一个系统中提供SIM和PALM这两种超分辨率成像方法.
目前可用于STED成像的显微镜是Leica公司TCS SP8显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）和来自Abberior公司（Abberior，Göttingen，Germany）的不同产品（不限于表2）. 型号为775 STED显微系统可以实现最小为20 nm的横向分辨率，而Easy3D STED可以获得75 nm 3D分辨率. Leica TCS SP8为激励脉冲激光束提供多达8个通道的多配置选项. 它还可以同时记录多达5种不同发射波长.STORM和PALM显微镜包括4种产品：Bruker公司（Bruker，Massachusetts，USA）的Vutara352型号产品，Oxford Nanoimaging公司的Nanoimager型号产品（Oxford Nanoimaging，Oxford，UK），Nikon公司的NSTORM 5.0型号产品和Zeiss公司的ELYRAP.1型号产品（表3）. 这四个系统在横向和轴向上具有相同分辨率. N-STORM5.0型号产品和ELYRA P.1型号产品可以提供大视场并支持三色成像. Nanoimager型号产品具有最高采集速度. Leica公司基于GSDIM显微原理的SR GSD 3D型号产品（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）显示出与上述4种系统类似的规格，但可用于各种荧光分子.表4罗列了Abberior公司的两种RESOLFT显微镜. 配备Abberior QUAD扫描仪和4个振镜的RESOLFT点扫描系统可以获得2 kHz扫描线频率. 双色RESOLFT并行系统还可通过快速sCMOS相机实现高速采集.尽管电子束光刻（RaiChoudhury，1997）或等离子体光刻（Pan et al., 2011）达到纳米分辨率，但这些技术仅可用于2D纳米加工. 三维光学激光光刻，也称为3D激光直写（DLW），已经实现三维纳米加工.在3D DLW中，脉冲激光通常以衍射极限点聚焦在光刻胶体积内. 利用双光子吸收和/或其他光学非线性，光刻胶在该体积内曝光. 控制曝光剂量减小曝光体积的横向和/或轴向尺寸可提高3D DLW分辨率. 然而，该分辨率仍然受到衍射极限限制. 由于在荧光显微镜中引入STED概念，基于超分辨率光诱导/抑制纳米光刻（SPIN）的类似想法已经被应用于3D DLW光刻技术（Li LJ et al., 2009; Scott et al., 2009; Fischer et al., 2010; Cao et al., 2011; Fischer and Wegener, 2011; Gan et al., 2013）.在常规DLW工艺中，光刻胶被激光激发，最终引发不可逆的化学反应，例如聚合. 对于常见的负性光刻胶，被曝光区域变得不可溶，而未曝光区域可在显影处理期间除去. SPIN方法利用抑制一些中间状态来减小激发和曝光的光刻胶尺寸. 通过与激发光束不同波长的第二激光可以诱导抑制过程. 目前已有三种SPIN技术被开发，我们将在下面讨论它们（图14）.![]()
图14 耗尽原理：（a）光致发光过程；（b）光漂白过程；（c）光自由基产生值得注意的是，光子生成不仅可以应用于单光子吸收（OPA），还可以应用于双光子吸收（TPA）. SE：受激发射；ISC：系间窜越；R：自由基；RM：传播聚合物链；Q：非引发自由基（转载自Fischer and Wegener（2013），根据 CC BY 4.0 获得许可）
在SPIN中（Fischer et al., 2010; Fischer and Wegener, 2011），光引发剂分子基于光致发光原理经由双光子吸收被激发. 在弛豫到S1状态后，它们利用受激发射返回基态，然后经系统间过渡进入三重态（T1）. 该过程会产生自由基，引发传播聚合物链，最后产生不可逆的交联聚合物.在SPIN中利用光失活效应（Li LJ et al., 2009），光引发剂分子经双光子吸收被激发并产生具有长寿命的中间态活性物质. 一旦光束激发分子，中间态就失活而不导致交联聚合.由光自由基生成的SPIN中（Scott et al., 2009; Cao et al., 2011; Gan et al., 2013），光引发剂分子经不同波长下单光子或双光子吸收而被激发，产生可引发聚合的自由基. 光抑制剂分子经单光子吸收或者另一个不同波长的双光子吸收而被激活. 产生的非引发基团可以清除引发自由基并终止传播链.上述3个原理使得亚波长DLW能够打印较小特征的结构. 超分辨率DLW的实验结果如表5所示. 到目前为止，利用2PII光刻技术和双光子吸收效应已实现最小特征尺寸（9 nm）和线分辨率（52 nm）的光刻样品（Gan et al., 2013）.
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3D亚衍射DLW为复杂3D纳米加工和3D数据存储提供了一个强大工具（Grotjohann et al., 2011）.
5.2 磁成像技术
应用于生命科学的磁共振成像可以为生物功能提供新信息. 动作电位沿神经元传播的研究最近引起广泛关注（Barry et al., 2016; Hortigon-Vinagre et al., 2016）. 此外，动物体内负责迁移和定向的磁性蛋白最近被发现（Qin et al., 2016）.
然而，当前技术在室温下无法达到高磁成像分辨率. 与光学显微镜相比，诸如磁共振成像（Lee SC et al., 2009）的一些技术只具有低空间分辨率（1–5 μm）. 因此，磁共振成像通常不适用于亚细胞结构成像.
允许磁场测量的其他技术包括扫描超导量子干涉装置显微镜（Finkler et al., 2010）、电子全息术（Dunin-Borkowski et al., 1998）和磁共振力显微镜（Degen et al., 2009）. 这些方法可达到亚微米分辨率，但被限制应用于活体生物样品.
NV−色心借助光学检测磁共振（ODMR）在室温下能够进行高空间分辨率的磁成像（Gruber et al., 1997）. 它在532 nm波长处被激发并发射宽带光，在637 nm波长处显示零光子线（Gruber et al., 1997）. 它还具有自旋三重基态，在ms=0和ms=±1自旋状态之间会进行约2.87 GHz的零场分裂（Pham et al., 2011）.
当NV−色心受到微波场激发时，处于基态的NV−色心电子群可能发生再分布. 当微波频率切换到零场分裂频率（2.87 GHz）时，粒子占据ms=±1状态变多，而占据ms=0状态变少（Gruber et al., 1997）. 因此，这导致光致发光效应减弱（ODMR信号），因为通过中间亚稳态而发生非辐射衰变.
如果还施加磁场，则ms=−1和ms=+1状态发生分裂，并且间隙与磁场强度成比例地增加. 微波场和磁场导致处于ms=−1和ms=+1状态的粒子数总体增加. 由于电子重新分布，ODMR信号显示为两个波谷. 两波谷间距随着施加的磁场强度而增加.
通过ODMR已经实现活体趋磁细菌（Le et al., 2013）、肿瘤细胞（Glenn et al., 2015）和哺乳动物细胞（Davis et al., 2018）微米级分辨率的磁成像. 具有纳米级分辨率的磁性成像需要将纳米级NV−色心在空间上的自旋分配作为前提条件.
在体金刚石中，超分辨率显微镜结合自旋分配已经通过电荷态耗尽（CSD）（Chen et al., 2015）、STORM（Chen et al., 2015）和RESOLFT（Jaskula et al., 2017）实现. CSD方法已达到4.1 nm空间分辨率. 在纳米金刚石中，基于ODMR闪烁定位显微镜可分辨两个相隔23 nm共同闪烁的NV−色心（Barbiero et al., 2017）.
6 结论
本文回顾了各种超分辨率显微镜的原理，包括它们基于荧光和非荧光的方法. 基于荧光的超分辨率显微镜分为两大类：空间域方法（SIM、SSIM、STED和RESOLFT）和时域方法（PALM、STORM、闪烁定位、MINFLUX和SOFI）.
除SIM、ISM和MINFLUX外，所有基于荧光的超分辨率显微镜方法都充分利用荧光探针的特殊性能. 荧光探针分成两种不同状态（开和关）来实现空间分辨率的显著增强. 开启状态可以提供所需荧光，与此相对，各种机制关闭状态不能发出荧光. 另一方面，将特殊材料技术应用于非荧光方法也可以实现超分辨率.
通常，基于荧光的超分辨率技术比基于非荧光的技术获得更优分辨率. 此外，指出许多荧光成像方法的成效，例如多色成像和活细胞成像. 基于荧光的超分辨率方法已经引发生物成像革命，推动各种生物学领域研究. 基于非荧光的超分辨率方法对样品没有特殊要求. 因此，它们可能具有更广泛的应用前景.
本文还介绍超分辨率显微镜的仪器现状，并比较商业产品的规格. 超分辨率方法在提高体内内窥镜成像分辨率方面具有潜在应用，目前该方法受到低数值孔径（NA）的限制. 将STED原理应用于双光子内窥镜，从而打破衍射极限并将分辨率缩小至其三分之一的水平，达到310 nm（Gu et al., 2014）.
受STED显微镜中超分辨率方法的启发，目前已开发3种SPIN方法，并将3D纳米加工成功应用于光学数据存储（Grotjohann et al., 2011; Gu et al., 2016）.
超分辨率光学磁成像作为理解生物过程的新工具非常有前景. 纳米金刚石中NV−色心的纳米级磁成像需要在空间上分配纳米级自旋. 生物样品的非侵入式纳米级磁性成像体现下一代超分辨率显微镜具有良好的应用前景.
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王宝凯：男，汉族，1990年生。哈尔滨工业大学仪器科学与技术专业硕士，现为澳大利亚皇家墨尔本理工大学在读博士研究生。哈尔滨工业大学超精密光电仪器工程研究所学习期间主要研究方向：共焦显微技术、超分辨成像技术；皇家墨尔本理工大学人工智能纳米光子学实验室学习期间主要研究方向：光纤内窥镜成像，超分辨成像技术，双光子激光直写技术，光学检测磁共振技术。曾参与国家自然科学基金面上项目2项，国家重大科学仪器专项子项目1项。发表SCI收录学术论文3篇，获发明专利9项。曾获本科校级优秀毕业论文，硕士优秀毕业论文，一等奖学金。
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顾敏教授：中国工程院外籍院士，为首位华裔澳大利亚科学院院士、澳大利亚技术科学与工程学院院士。2019年荣获国际光学及光子学学会丹尼斯盖博奖。现任上海理工大学校务委员会执行主席及光电信息与计算机工程学院教授。中国教育部长江学者讲座教授，中国科学院爱因斯坦讲席教授。他是上海交通大学等高校、研究所的顾问教授,上海光机所等高校、研究所的荣誉教授及多个高校的客座教授。他是澳大利亚光学学会Beattie Steel奖 (澳大利亚光学界最高荣誉)、澳大利亚物理学会Boas奖 (澳大利亚物理界最高荣誉)、澳大利亚科学院Ian Wark奖 (澳大利亚科技界最高荣誉)及澳大利亚维多利亚科学创新奖 (澳大利亚科学创新最高荣誉) 的获得者。被澳大利亚国家研究委员会授于桂冠教授（澳大利亚科技最高荣誉）。曾任澳大利亚皇家墨尔本理工大学主管科技创新创业的副校长及杰出教授。澳大利亚斯威本大学副校长(研究能力)、光电子学首席终身杰出教授、微光子学中心首任主任,澳大利亚维多利亚州先进太阳能设备中心主任。中国第二、三届国务院侨办海外专家咨询委员会委员。中国海外交流协会第五、六届理事会常务理事。北京市政府海外人才工作顾问。青岛市开发区科技顾问。曾任第三届澳中科技教育专题大会主席和全澳华人专家学者联合会主席及其顾问委员会主席。
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Frontiers of Information Technology & Electronic Engineering（简称FITEE，中文名《信息与电子工程前沿（英文）》，ISSN 2095-9184，CN 33-1389/TP）是信息电子类综合性英文学术月刊，SCI-E、EI收录，最新影响因子1.604，进入JCR Q2分区。前身为2010年创办的《浙江大学学报英文版C辑：计算机与电子》，2015年更为现名，现为中国工程院信息与电子工程学部唯一院刊。覆盖计算机、信息与通信、控制、电子、光学等领域。文章类型包括研究论文、综述、个人视点、评述等。现任主编为中国工程院院士潘云鹤、卢锡城。实行国际同行评审制，初次转达意见一般在2~3个月内。文章一经录用将快速在线。
2019年，荣获中国科协等七部委推出的中国科技期刊卓越行动计划项目资助（梯队期刊）。
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